不同時間窗中藥對血管性癡呆小鼠腦神經遞質的影響*

河北工業大學醫院 孫麗芳 張麗欣 高 紅 (天津300130)

隨著人們生活水平的提高，腦血管病成為了嚴重影響人們健康和生命安全的疾病之一。近年來，醫療水平亦不斷提高，雖然腦血管疾病病死率有所下降，但腦血管病造成的各種功能和智力障礙卻得不到有效治療。血管性癡呆(VD)是由多種因素導致腦組織受到損傷后引起的癡呆綜合征的總稱。［1］臨床實踐中發現，中醫藥在治療VD 方面有較顯著療效，但治療本病的最佳時機卻不明確。［2］本研究通過復制血管性癡呆小鼠模型，觀察不同時間窗中藥益氣活血方治療血管性癡呆的療效，為臨床選擇合適時機治療該病提供可靠的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物 雄性昆明小鼠50 只，體質量29 g±2.5 g (由河北醫科大學實驗動物學部提供)。

1.2 益氣活血方的藥物組成 黃芪120 g，赤芍、當歸各9 g，地龍、桃仁、紅花、川芎各6 g(課題組自制成1 g 生藥/mL)。本實驗中所應用的中藥均購自北京同仁堂藥房，經過河北醫科大學中醫學院中藥系的鑒定后均符合國家藥典標準。

1.3 本實驗主要試劑 去甲腎上腺素(NE)、5－羥色胺(5－TH)、多巴胺(DA)均由中國生物藥品制品檢驗所提供。

1.4 本實驗主要儀器 C－R2Ax 數據處理機、LC－4A 高效液相色譜儀均為日本島津公司生產。

2 方法

2.1 模型復制 模型的制備參照文獻，［3］將動物用10%水合氯醛(350 mg/kg，腹腔注射)麻醉，頸正中部常規消毒后切口，分離雙側頸總動脈，套“4”號絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流20 min，同時在距尾尖1 cm 處剪斷放血約0.3 mL，熱凝止血。松開絲扣使血液灌注10 min 后，再次阻斷血流20 min，第2 次再灌注后觀察30 min，縫合皮膚。其中假手術組只分離頸總動脈，穿線不結扎，尾部不放血，觀察時間與其他組相同。術后每日肌注青霉素0.2 萬U，連續3 d。本實驗維持動物肛溫36℃±0.5℃，防止低溫對缺血所致腦損傷的保護作用。

2.2 實驗的分組及給藥途徑 將實驗用昆明小鼠隨機分為5 組，每組為10 只，均連續給藥治療10 天，每日給藥1 次。(1)假手術組:予蒸餾水按10 mL/kg 體質量灌服;(2)模型組:予蒸餾水按10 mL/kg 體質量灌服;(3)益氣活血方即刻治療組:每日予36 g 生藥/kg 體質量灌服(此劑量相當于成人服藥劑量的15 倍)，造模后即刻給藥。(4)益氣活血方3 天治療組:相同劑量藥物，造模3 天后給藥。(5)益氣活血方10 天治療組:相同劑量藥物，造模10 天后給藥。

2.3 腦內神經遞質測定 在治療結束后，各組小鼠均快速斷頭取腦組織，在冰盤上分離出其大腦皮層，放于－80℃冰箱中。取部分組織做樣品，以3 000 r/min、4℃離心10 min，將離心后的上清液，置于1.5 mL Ependorf 管中，提取NE、DA、5－TH時備用。標準品與樣品的處理方法相同。

計算NE、DA 的公式為:

NE、DA 含有量=補正系數×面積×內部標準量×100/內部標準峰面積×試樣量。

計算5－TH 的公式為:

5－TH 含有量=補正系數×面積×100/試用量，分析標準試樣后求得補正系數。

2.4 統計學處理 實驗中的所有數據用SPSS13.0 for windos 統計軟件進行統計，用成組設計的方差分析，數據采用±s 表示。以0.05、0.01 為差異有顯著性水平的標準。

3 結果

益氣活血方對各組VD 模型小鼠其大腦皮層中的各種神經遞質影響:研究結果顯示，大腦皮層組織中的神經遞質模型組與假手術組相比明顯降低(P＜0.01);經用益氣活血方后，即刻治療組、3天治療組NE、DA、5－TH 含量均較模型組小鼠明顯增高(P＜0.05)，10 天治療組含量雖有增高，但差異無顯著性(P＞0.05)，其中，即刻治療組腦組織中的NE、DA、5－TH 含量均較3 天治療組明顯增高(P＜0.05)。詳見表1。

表1 益氣活血方對VD 模型小鼠大腦皮層中神經遞質的影響 (±s)，ng/g 濕重

表1 益氣活血方對VD 模型小鼠大腦皮層中神經遞質的影響 (±s)，ng/g 濕重

注:與模型組比較，* P＜0.05、＊＊P＜0.01;與3 天治療組比較，△＜0.05

組別 例數(只)NE DA 5－TH假手術組 10 285.34±57.63＊＊ 554.75±90.51＊＊ 703.40±110.31＊＊模型組 10 169.52±35.89 234.18±43.72 413.09±73.12即刻治療組 10 249.47±40.42＊＊△ 504.83±85.49＊＊△ 653.71±88.45＊＊△3 天治療組 10 205.72±37.13* 423.47±81.32* 534.77±85.10*10 天治療組10 198.35±36.41 277.08±52.47 483.12±81.39

4 討論

中醫對VD 的研究由來已久，《景岳全書》中第一次提出癡呆的病名、病因與臨床表現，古代醫學家認為本病系年邁體衰，正氣虧虛，運行不暢，氣虛血瘀等導致，并認為其主要病機［4］為中風導致氣血瘀滯，清竅失靈，漸至癡呆。病位在腦，病性多為本虛標實，精血虧虛為本，痰瘀互結、蒙蔽清竅為標。益氣活血方藥物組成應用補陽還五湯原方。該方為益氣活血通絡的經典方，由黃芪、當歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍組成。方中黃芪重用為君，大補元氣，意在氣旺以促血行，祛瘀而不傷正;配以當歸尾為臣，有活血祛瘀而不傷正氣之妙;桃仁、紅花、川芎、赤芍助當歸尾活血祛瘀，其中川芎具升浮之性，善上行頭巔，為治腦部瘀血證之良藥，地龍通經活絡，共為佐使。［5］諸藥合用，使氣旺血型、祛瘀絡通，腦髓得養，靈機記性漸歸于常。

現代研究表明，引起血管性癡呆的因素主要為腦缺血，［6］而腦缺血又可以造成神經遞質的代謝異常。腦缺血早期，由于ATP 尚未消耗完畢，所以神經遞質的合成與釋放受到的影響均較小，減少不明顯，然而神經遞質的分解過程耗能相對更大，故而受到影響較大，造成其合成釋放較分解增加，所以突觸間隙神經遞質的含量會較前有所升高。大腦缺血的時間越長，胺泵以及膜泵受到抑制越大，造成突觸前膜再次攝取神經遞質會明顯減少甚至停止。在這時，鈉泵轉運受到阻礙又會造成一部分細胞變得水腫，進而破裂。遞質外溢后，細胞外液遞質仍會較前增高;腦缺血的后期，遞質合成受到影響，遞質合成不足，故儲存在囊泡中的神經遞質也會相應的減少，神經元會更加受損，以致于部分神經元壞死，也就喪失了合成、釋放神經遞質的能力。［7］本實驗中血管性癡呆的模型就是反復缺血再灌注引起，而時間窗的概念正是緣于治療缺血性卒中。

研究表明，“缺血半暗帶”的提出，為缺血性卒中的治療提供了理論基礎。［8］缺血半暗帶是壞死灶的中心與正常組織間的交接區，該區域雖然細胞結構存在但細胞功能受到損害，這一部分缺血的腦組織因缺血影響細胞的電生理活動，造成電生理活動的停止，但是仍然可以維持跨膜離子的平衡。距離腦缺血中心較近的腦組織發展為不可逆性腦損傷時間較為緩慢，甚至可能延遲到數小時。缺血半暗帶從可逆性的缺血向不可逆性損傷的進展由多種病理機制參與，隨著缺血時間的延長，最終導致治療效果降低。研究提示，缺血半暗帶的面積、大小受很多因素的影響，例如:側支循環的建立、患者血壓、當時的體溫以及缺血組織對缺血的耐受性等。［9］因此，因缺血導致卒中的治療時間窗有一定的個體差異。由此可見，因腦缺血再灌注導致的血管性癡呆，在治療中也存在時間窗的概念。

本研究還顯示，VD 小鼠大腦皮層組織中NE、DA、5－TH 的含量模型組與假手術組比較明顯降低(P＜0.01)，說明了單胺類神經遞質代謝紊亂參與了腦缺血損害病理過程。益氣活血方即刻治療組、3 天治療組中NE、DA、5－TH 的含量均較模型組有顯著提高(P＜0.05)，其中，即刻治療組中腦組織中的NE、DA、5－TH 含量均較3 天治療組明顯增高(P＜0.05)。提示較早期治療效果顯著，其機理之一可能為通過改善單胺類神經遞質的代謝，使皮層內神經遞質的含量增加，進而缺血半暗帶發生了可逆性變化。10 天治療組含量雖有增高，但差異無顯著性(P＞0.05)，表明隨著時間推移，半暗帶從潛在的可能性缺血逐漸向不可逆性損傷的進展。

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