側(cè)腦室微量注射ghrelin對大鼠小腸轉(zhuǎn)運和肌電活動的影響及作用機制

王 燕，李 路，史海濤，趙菊輝，姜 炅，賈 淼

(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710004)

Ghrelin是從大鼠胃中分離出來的一種腦腸肽，是生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的內(nèi)源性配體。已有研究發(fā)現(xiàn)，中樞和靜脈注射ghrelin可促進胃酸分泌，加速胃排空，加速結(jié)腸傳輸，改善術后腸梗阻［1，2］。消化間期復合肌電活動(interdigestive myoelectric complex，IMC)是一種禁食狀態(tài)下存在的時相性、周期性肌電活動，其受中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸激素等多因素共同調(diào)控，可促進胃排空及腸道運動，有重要的生理意義。近來研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin可誘發(fā)進食大鼠的禁食期肌電活動，縮短小腸 IMC 周期，刺激禁食期胃腸動力［3，4］。然而，中樞給予ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運和小腸IMC的影響及機制尚未見報道。本實驗探討了側(cè)腦室微量注射ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運和IMC的影響及作用機制，為治療胃腸動力障礙性疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康純種Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，體重220－240 g，由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。所有動物實驗均符合西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心管理委員會動物管理和使用的有關規(guī)定。

1.2 儀器和試劑

Ghrelin購自美國Phoenix Peptide公司，普萘洛爾及伊文氏藍購自美國 Sigma公司，(D-Lys3)GHRP-6購自美國Anaspec公司，阿托品購自無錫第七制藥有限公司，酚妥拉明購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，聚四氟乙烯薄膜包繞的AF-250A醫(yī)用線纜購自上海信息產(chǎn)業(yè)部電子第23研究所特種線纜部，多道生理記錄儀RM-6280C購自成都儀器廠。

1.3 側(cè)腦室套管置入

大鼠術前禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉，固定于中樞立體定位儀，頭部去除毛發(fā)，消毒，剪去直徑約1 cm面積的皮膚，顯露前囟，按照SD大鼠腦立體定位圖譜，將中樞套管置入側(cè)腦室。側(cè)腦室坐標(前囟后1.0 mm，正中線旁開2.0 mm，顱骨表面下3.5 mm)，用牙托粉和牙科水泥固定外套管，并用小螺絲釘加固，橡膠塞封套管外口。術后3 d動物恢復良好，可用于實驗。側(cè)腦室微量注射采用5μl微量進樣器經(jīng)頭部預置的套管注入，注射體積為5μl，針尖伸出套管末端1 mm緩慢注入，注射后將微量注射器保留2 min，防止藥物回流。

1.4 小腸轉(zhuǎn)運試驗

1.4.1 埋置十二指腸導管 腦部手術3 d后，實驗大鼠禁食18 h，10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，外科無菌操作下沿腹正中線剪開腹壁肌肉及腹膜，用注射針頭在十二指腸距幽門1 cm處刺入腸腔，將一根聚乙烯導管(內(nèi)徑0.58 mm，外徑0.98 mm)經(jīng)穿刺點植入十二指腸腔內(nèi)，導管在腸腔內(nèi)約留置1 cm，用絲線將導管荷包縫合。在大鼠右上腹及肩胛間區(qū)之間做皮下隧道，在體外固定導管，用大頭針封住導管的露出端。術后大鼠分籠清潔飼養(yǎng)，恢復1周可用于實驗。

1.4.2 實驗設計 實驗大鼠禁食24 h，隨機分為6組(n=6):生理鹽水組(5 μl)，ghrelin(0.4 μg/kg)，ghrelin(1.6 μg/kg)，ghrelin(6.4 μg/kg)，(D-Lys3)GHRP-6(3.7 μg/kg)，(D-Lys3)GHRP-6(3.7 μg/kg)+ghrelin(6.4μg/kg)。所給藥物溶于5μl生理鹽水，最后一組大鼠的兩次給藥間隔時間為15 min。注入藥物或生理鹽水后，經(jīng)十二指腸導管注入0.1 ml伊文氏藍溶液。用0.1 ml生理鹽水沖洗導管，保證導管內(nèi)的染料均進入十二指腸。20min后將大鼠脫頸椎處死，立即打開腹腔，用絲線扎緊幽門和回盲瓣，剪取上自幽門、下至回盲瓣的腸管。分離腸系膜，將小腸擺放成直線進行測量。從幽門到回盲瓣的腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至染料移行前沿長度為“染料移行長度”，小腸轉(zhuǎn)運率 (%)=染料移行長度(cm)/小腸總長度(cm)×100%。

1.5 電生理試驗

1.5.1 埋置電極 在導線末端2 cm處去除1.0 mm長度的外膜，將裸露出的銀絲作為電極使用。腦部手術3 d后，實驗大鼠禁食18 h，腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，外科無菌操作下沿腹正中線剪開腹壁肌肉以及腹膜，以7號注射針頭作套針穿過腸壁漿肌層，使每根導線的裸露段(約1 mm)留在漿肌層里作為記錄電極。分別在大鼠的十二指腸和空腸各埋置一對電極，十二指腸電極距幽門5 cm，空腸電極距幽門15 cm。每對電極相距約2 mm，電極連線與空腔臟器長軸垂直。用絲線將導線扎緊，防止移動脫落。在大鼠右上腹及肩胛間區(qū)之間做皮下隧道，在體外固定導線。術后大鼠分籠清潔飼養(yǎng)，恢復1周可用于實驗。

1.5.2 實驗設計 大鼠隨機分為12組(n=6)，四組用于觀察ghrelin對IMC影響的中樞機制，8組用于觀察ghrelin對IMC影響的外周機制。Ghrelin對IMC影響的中樞機制:兩組經(jīng)側(cè)腦室給予生理鹽水5μl，15 min后再經(jīng)側(cè)腦室給予生理鹽水5μl或ghrelin 6.4μg/kg;另兩組分別經(jīng)側(cè)腦室給予(D-Lys3)GHRP-6(3.7μg/kg)，15 min后再經(jīng)側(cè)腦室給予生理鹽水5μl或ghrein 6.4μg/kg。Ghrelin對IMC影響的外周機制:兩組經(jīng)尾靜脈給予生理鹽水0.3 ml，10 min后再經(jīng)側(cè)腦室給予生理鹽水或ghrelin 6.4 μg/kg;6組分別經(jīng)尾經(jīng)脈給予阿托品1 mg/kg、酚妥拉明1 mg/kg或普萘洛爾1 mg/kg，10 min后再經(jīng)側(cè)腦室給予生理鹽水或ghrelin 6.4μg/kg。

1.5.3 肌電活動的記錄 實驗大鼠禁食16 h，在清醒狀態(tài)下測定肌電活動。用大鼠固定器束縛大鼠，將電極與多道生理記錄儀連接，記錄小腸肌電活動。時間常數(shù)設為0.2 s，采樣頻率為1 kHz，低頻濾波和高頻濾波分別為0.8 Hz和100 Hz，信號幅度以μV記。大鼠肌電信號分析指標:IMC周期(min，測量從前一個IMC的結(jié)束處到下一個IMC的結(jié)束處)，Ⅲ相出現(xiàn)的頻率(次/min)，振幅(μV)，時相(min)及Ⅲ相時相占IMC周期百分比。

1.6 組織學檢查

實驗結(jié)束后，各組大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔，經(jīng)左心室穿刺至主動脈，用生理鹽水快速沖血管床，用4%多聚甲醛緩沖液經(jīng)升主動脈緩慢灌注，開顱取腦，切成4 mm厚小塊(避開針眼部位)，固定于4%甲醛溶液中24 h，用20%－30%蔗糖溶液梯度脫水，組織包埋劑包埋，恒冷冰凍切片機切片，腦片厚約20μm，觀察腦片內(nèi)套管軌跡，不正確者棄去。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 側(cè)腦室注射ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運的影響

側(cè)腦室注射生理鹽水后大鼠的小腸轉(zhuǎn)運率為54.94%±7.07%，與正常大鼠64.01%±8.50%相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與生理鹽水對照組相比，ghrelin 0.4μg/kg似乎對小腸轉(zhuǎn)運有促進作用，小腸轉(zhuǎn)運率為62.22%±7.88%，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Ghrelin 1.6μg/kg和6.4μg/kg促進小腸轉(zhuǎn)運，小腸轉(zhuǎn)運率分別為70.09%±9.18%和74.08%±7.75%(P＜0.01)。單獨給予ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6對小腸轉(zhuǎn)運有抑制作用(40.86%±6.17%，P＜0.05)，與ghrelin聯(lián)合注射則阻斷了其促動力作用(56.59%±8.78%，P＜0.01，見圖1)。

圖1 側(cè)腦室注射ghrelin對禁食大鼠小腸轉(zhuǎn)運的影響Figure 1 Effect of intracerebroven tricular injection of ghrelin on small intestinal transit in fasted rats

2.2 經(jīng)側(cè)腦室注射ghrelin對IMC的影響

向大鼠側(cè)腦室注射生理鹽水5μl，十二指腸和空腸IMCⅢ相的頻率、振幅、時相、Ⅲ相占IMC周期百分比以及IMC周期與正常大鼠的各參數(shù)相比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表1)。側(cè)腦室注射ghrelin 6.4μg/kg，大鼠十二指腸和空腸的肌電活動均有不同程度的增加。與鹽水組相比，十二指腸IMC周期和Ⅲ相時程縮短(P分別＜0.001和＜0.05)，Ⅲ相振幅和頻率增加(P＜0.05)。空腸IMC周期和Ⅲ相時程顯著縮短(P分別＜0.01和＜0.05)，Ⅲ相振幅增加(P＜0.05)。但空腸Ⅲ相頻率無顯著改變，十二指腸和空腸的Ⅲ相占IMC周期百分比均無顯著變化(見表1，圖2)。

表1 側(cè)腦室注射ghrelin后大鼠IMC的特征參數(shù)變化(±s)Table 1 IMC characteristics of rats after intracerebroventricular injection of ghrelin(±s)

表1 側(cè)腦室注射ghrelin后大鼠IMC的特征參數(shù)變化(±s)Table 1 IMC characteristics of rats after intracerebroventricular injection of ghrelin(±s)

與鹽水組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

鹽水組 12.03±1.45 19.04±1.57 324.68±63.38 3.50±0.78 29.09±5.07 Ghrelin組 7.89±1.35＊＊ 23.38±3.06* 426.17±82.81* 2.42±0.66* 30.51±5.07空腸正常組 12.39±1.47 19.88±1.86 323.11±59.54 3.97±0.81 32.18±5.56鹽水組 13.20±1.98 20.27±2.25 302.75±71.22 4.04±1.20 30.33±6.05 Ghrelin組 8.84±1.76＊＊ 23.62±3.01 408.71± 77.54* 2.63±0.81*29.48±5.91

圖2 側(cè)腦室注射ghrelin后大鼠胃腸IMC的改變Figure 2 Effects of intracerebroventricular injection of ghrelin on IMCin rats

2.3 側(cè)腦室注射受體拮抗劑對ghrelin增強IMC效應的影響

經(jīng)側(cè)腦室單獨給予ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6，IMC的周期無顯著改變，與ghrelin聯(lián)用則抑制ghrelin的促動力作用，IMC周期均顯著延長(十二指腸:P＜0.05，空腸:P＜0.01，見表2)。

表2 側(cè)腦室注射(D-Lys3)GHRP-6對ghrelin增強IMC效應的影響(±s)Table 2 Changes of IMC after intracerebroventricular injection of(D-Lys3)GHRP-6 and ghrelin(±s)

表2 側(cè)腦室注射(D-Lys3)GHRP-6對ghrelin增強IMC效應的影響(±s)Table 2 Changes of IMC after intracerebroventricular injection of(D-Lys3)GHRP-6 and ghrelin(±s)

與鹽水+鹽水組比較，*P＜0.01;與鹽水+ghrelin組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

(D-Lys3)GHRP-6 鹽水 (D-Lys3)GHRP-6 ghrelin 11.43±2.11# 12.50±2.03##

2.4 靜脈注射各種藥物對ghrelin增強IMC效應的影響

單獨注射阿托品可延長小腸IMC周期(十二指腸:P＜0.01，空腸:P＜0.05)。阿托品與ghrelin聯(lián)合注射則抑制ghrelin的促動力作用，十二指腸和空腸的IMC周期均延長(P＜0.05)。酚妥拉明和普萘洛爾單獨注射，對小腸IMC周期均無明顯影響，與ghrelin聯(lián)用注射對ghrelin的作用也無顯著影響(見表3)。

3 討論

表3 靜脈注射各種藥物對ghrelin增強IMC效應的影響(±s)Table 3 The changes of IMC after intravenous injection of relative drugs and ghrelin(±s)

表3 靜脈注射各種藥物對ghrelin增強IMC效應的影響(±s)Table 3 The changes of IMC after intravenous injection of relative drugs and ghrelin(±s)

與鹽水+鹽水組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與鹽水+ghrelin組比較，#P＜0.05

普萘洛爾

腦腸肽ghrelin主要由胃黏膜的泌酸細胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學作用，可促進生長激素分泌，促進胃排空，加速小腸轉(zhuǎn)運，促進結(jié)腸傳輸，增加調(diào)節(jié)能量代謝，促進攝食等［1，2］。Ghrelin與調(diào)節(jié)消化道運動的激素胃動素在結(jié)構(gòu)上高度相似，其前體結(jié)構(gòu)及氨基酸序列與胃動素有36%的同源性，其受體與胃動素受體有44%的同源性，跨膜區(qū)同源性高達87%。因此，近年來，ghrelin與消化道運動的關系越來越受到關注。以往研究證實，ghrelin和其受體GHS-R在中樞和外周均有表達［1，5］。側(cè)腦室和靜脈注射ghrelin可促進攝食，誘發(fā)進食大鼠的禁食期肌電活動［3，6］，靜脈注射 ghrelin 促進胃排空、小腸轉(zhuǎn)運和結(jié)腸傳輸［7－9］。但側(cè)腦室注射ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運及消化間期肌電活動的影響尚未見報道。c-Fos基因是一種即刻早期基因，被稱為核內(nèi)“第三信使”，c-Fos的表達可作為接受一定刺激的神經(jīng)元激活的標志。大鼠中樞注射ghrelin可增加下丘腦室旁核、背內(nèi)側(cè)核、弓狀核、延髓孤束核和最后區(qū)的c-Fos表達［10，11］。腹腔注射ghrelin也可誘發(fā)中樞的c-Fos表達［12］。這些均提示，中樞與 ghrelin的生理功能密切相關，ghrelin有可能通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮其生理作用。本實驗在此基礎上觀察了側(cè)腦室微量注入ghrelin對大鼠小腸轉(zhuǎn)運和消化間期IMC的影響，就其作用機制進行探討。

我們的實驗證實側(cè)腦室微量注射ghrelin促進小腸轉(zhuǎn)運，其受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6顯著阻斷其促動力作用。Fukuda等通過觀察ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運和胃排空的影響［13］，提出ghrelin可能通過對辣椒辣素敏感的感覺傳入神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)在神經(jīng)通路促進胃腸運動，但沒有研究量效效應和受體拮抗劑的作用。此外，F(xiàn)ukuda等采用將鉻酸鈉(Na51CrO4)灌入大鼠胃中的方法來觀察小腸轉(zhuǎn)運，但這尚受到胃排空的影響，并不是單獨的小腸轉(zhuǎn)運。我們的實驗采用在大鼠十二指腸置管，經(jīng)導管注入伊文氏藍的方法來觀察ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運的影響，并研究量效效應，觀察了ghrelin受體拮抗劑的作用。由于ghrelin和GHS-R在中樞和外周組織都有分布，以往研究認為中樞和外周給予ghrelin，可分別通過中樞和外周的GHS-R來發(fā)揮胃腸動力調(diào)節(jié)作用［11］。因此，本實驗推測在生理條件下，側(cè)腦室的內(nèi)源性ghrelin可能通過側(cè)腦室的GHS-R發(fā)揮促小腸轉(zhuǎn)運作用。

實驗結(jié)果表明，側(cè)腦室微量注入ghrelin對大鼠小腸IMC有促進作用，IMC周期和Ⅲ相時程顯著縮短。經(jīng)側(cè)腦室給予 ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6可阻斷 ghrelin對IMC的促進作用。這提示在生理狀態(tài)下，中樞的內(nèi)源性ghrelin可能通過中樞的GHS-R參與對IMC的調(diào)節(jié)作用。然而本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)側(cè)腦室單獨給予(D-Lys3)GHRP-6對IMC并無影響。Fujino等也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜脈或腦室單獨給予(D-Lys3)GHRP-6對大鼠胃腸的禁食期肌電活動均無顯著影響，但將大鼠的迷走神經(jīng)切除后，再經(jīng)靜脈單獨給予(D-Lys3)GHRP-6可打斷禁食期肌電活動，使之轉(zhuǎn)換為進食期運動模式［3］。以往研究提出中樞單獨應用NPY抗體可完全阻斷正常大鼠十二指腸的禁食期肌電活動［14］。因此，我們推測在生理條件下，大鼠IMC主要受中樞的NPY支配。當迷走神經(jīng)切除破壞了中樞的支配，ghrelin可能會首先參與對IMC的調(diào)控。

為進一步研究側(cè)腦室注射ghrelin促進小腸IMC的機制，在側(cè)腦室微量注射ghrelin之前分別經(jīng)靜脈給予酚妥拉明、普萘洛爾、阿托品，依次阻斷α和β腎上腺能受體，M膽堿能受體。實驗發(fā)現(xiàn)酚妥拉明和普萘洛爾均對ghrelin的促IMC作用無顯著影響，單獨注射阿托品明顯抑制ghrelin對小腸IMC的促進作用。因此可推測側(cè)腦室微量注射ghrelin對大鼠小腸IMC的促進作用與膽堿能通路有關，與α和β受體途徑無關。

綜上所述，側(cè)腦室微量注射ghrelin可劑量依賴性地促進大鼠小腸轉(zhuǎn)運，其受體拮抗劑則抑制小腸轉(zhuǎn)運。側(cè)腦室微量注射ghrelin促進小腸IMC，此作用可能與膽堿能通路密切相關。Ghrelin受體GHSR在ghrelin的促小腸運動作用中發(fā)揮重要作用。這些可以為今后研究胃腸動力障礙性疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

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