PK7300全自動(dòng)血型分析儀測(cè)定ABO 血型抗體效價(jià)的初步研究

石紹川，劉東，李軍，田耘博，陳鵬（重慶市血液中心 400015）

血型檢測(cè)是無償獻(xiàn)血篩檢的重要檢測(cè)項(xiàng)目，長(zhǎng)期以來，血站的血型檢測(cè)主要采用手工操作的紙片法。但隨著檢測(cè)技術(shù)的迅猛發(fā)展，紙片法已不能滿足實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化的要求，其檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)逐步被相應(yīng)的自動(dòng)化設(shè)備所替代［1－2］。Olympus PK7300全自動(dòng)血型分析儀集自動(dòng)加樣、孵育、判讀、數(shù)據(jù)保存及全過程監(jiān)控為一體，近年來我國(guó)的一些血液中心和中心血站陸續(xù)引進(jìn)了該設(shè)備。本中心檢驗(yàn)科自2011年將PK7300血型分析儀用于ABO 和Rh（D）血型的常規(guī)檢測(cè)，在使用過程中，作者發(fā)現(xiàn)該儀器除具有全自動(dòng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)外，其在不規(guī)則抗體和亞型篩選、測(cè)定ABO 血型抗體效價(jià)等方面也體現(xiàn)出較為卓越的性能，但將其用于測(cè)定ABO 血型抗體效價(jià)的報(bào)道較少。為此，本文對(duì)應(yīng)用PK7300全自動(dòng)血型分析儀測(cè)定ABO 血型抗體效價(jià)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源選擇本中心檢驗(yàn)科2013年5～7月無償獻(xiàn)血者的血液檢測(cè)標(biāo)本。隨機(jī)抽取日常檢測(cè)后的標(biāo)本A型、B型、O型各10例，進(jìn)行ABO 血型抗體效價(jià)測(cè)定，并對(duì)檢測(cè)出的ABO 血型抗體效價(jià)降低的情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 儀器白洋600A型離心機(jī)、eppendorf 100～1000μL可調(diào)移液器、Olympus PK7300全自動(dòng)血型分析儀。

1.3 試劑抗RhD－IgM（德國(guó)Biotest公司），單克隆抗A、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；反定型用紅細(xì)胞試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；生理鹽水（四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司）。以上試劑均鑒定合格，在有效期內(nèi)使用。

1.4 方法

1.4.1 儀器微板法測(cè)定抽樣樣本的ABO 血型抗體效價(jià)隨機(jī)抽取日常檢測(cè)后的標(biāo)本A型、B型、O型各10例，分別對(duì)每例標(biāo)本的血漿用生理鹽水進(jìn)行1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶60、1∶80稀釋；啟動(dòng)PK7300，按要求放入工作試劑，將上述每例稀釋的血漿標(biāo)本依次裝入專用樣本架的第2～8位，樣本架的第1位裝入未稀釋的原標(biāo)本（2500r／min 離心10 min，下層為紅細(xì)胞），然后將樣本架安裝至血型分析儀的進(jìn)樣單元，血型分析儀自動(dòng)進(jìn)樣并檢測(cè)各個(gè)試驗(yàn)微孔的凝集情況，自動(dòng)判讀各標(biāo)本的RhD 血型及ABO 血型。根據(jù)儀器檢測(cè)的各個(gè)測(cè)試孔的凝集情況，以與試劑紅細(xì)胞發(fā)生陽(yáng)性凝集的血漿標(biāo)本中最大稀釋倍數(shù)者的稀釋倍數(shù)作為該抽樣標(biāo)本的相應(yīng)血型抗體的效價(jià)。

1.4.2 儀器微板法及手工試管法測(cè)定各血型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)按血型不同在上述各例抽樣標(biāo)本中分別取100μL血漿標(biāo)本混合配制成A型、B型、O型混合血漿。儀器微板法測(cè)定A型、B型、O型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)（但各樣本架的第1位裝入的未稀釋標(biāo)本下層無紅細(xì)胞）。將儀器微板法中使用的未稀釋及稀釋的混合血漿標(biāo)本用手工試管法測(cè)定各型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)：準(zhǔn)備兩個(gè)試管架及適量透明潔凈的小試管并標(biāo)記，在試管架一中以100μL血漿加2滴試劑紅細(xì)胞的比例向各試驗(yàn)試管底部加入待測(cè)血漿及試劑紅細(xì)胞（簡(jiǎn)稱試管法一，此方法為本中心現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的操作方法），在試管架二中以100μL血漿加1滴試劑紅細(xì)胞的比例向各試驗(yàn)試管底部加入待測(cè)血漿及試劑紅細(xì)胞（簡(jiǎn)稱試管法二，此方法為本研究中的一種對(duì)比方法），其中A型混合血漿加BC，B型混合血漿加A1C，O型混合血漿分別加A1C和BC，混勻各管，以1000r／min離心1min，按照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程的凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)判讀各試驗(yàn)管的凝集情況［3］，將1＋以上凝集視為陽(yáng)性凝集，以與試劑紅細(xì)胞發(fā)生陽(yáng)性凝集的混合血漿標(biāo)本中最大稀釋倍數(shù)者的稀釋倍數(shù)作為該型混合血漿相應(yīng)血型抗體的效價(jià)。

1.4.3 分析本中心2013年5～7月檢測(cè)出的ABO 血型抗體效價(jià)降低的情況在本中心檢驗(yàn)科的日常血型檢測(cè)中，如遇到因?yàn)锳BO 血型抗體效價(jià)降低而導(dǎo)致儀器不能正確判讀標(biāo)本血型時(shí)，則取該標(biāo)本用試管法檢測(cè)其正反定型，如正反定型相符則以試管法檢測(cè)的結(jié)果報(bào)告，如正反定型不符或凝集強(qiáng)度仍降低，則送檢到輸血研究室進(jìn)一步做ABO 血型確認(rèn)試驗(yàn)；試管法或送檢到輸血研究室的確認(rèn)檢測(cè)均予以登記記錄。依據(jù)試管法或送檢的確認(rèn)檢測(cè)登記表及微板圖像查找本中心2013年5～7月檢測(cè)出的ABO 血型抗體效價(jià)降低的情況，對(duì)ABO血型抗體效價(jià)降低的獻(xiàn)血者信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 儀器微板法測(cè)定抽樣標(biāo)本的ABO 血型抗體效價(jià)的結(jié)果見表1。作者分別用兩種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)該效價(jià)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。將效價(jià)值取對(duì)數(shù)后進(jìn)行t檢驗(yàn)的結(jié)果：A型與B型比較的P值為0.619，A型與O型比較的P值為0.059，B型與O型比較的P值為0.014。Mann－Whitney秩和檢驗(yàn)結(jié)果：A型與B型比較的P值為0.425，A型與O型比較的P值為0.017，B型與O型比較的P值為0.005。

2.2 儀器微板法及手工試管法測(cè)定各血型混合血漿的ABO血型抗體效價(jià)的凝集反應(yīng)情況見表2。其中，儀器微板法的凝集反應(yīng)情況結(jié)果類型有＋、－、？3種；手工試管法的凝集反應(yīng)情況結(jié)果類型有4＋、3＋、2＋、1＋、±、MF（mixed field，混合凝集外觀）、－等7種。對(duì)3種方法測(cè)定的抗體效價(jià)結(jié)果進(jìn)行Friedman秩和檢驗(yàn)，P值為0.018。

2.3 本中心2013年5～7月共檢出ABO 血型抗體效價(jià)降低的獻(xiàn)血者43例，按血型分A型（抗－B 降低）33例、B型（抗－A降低）5例、O型（抗－A 降低2例及抗－B降低3例）5例，按性別分男35例、女8例，按年齡分18～＜25歲6例、25～＜35歲10例、35～＜45歲13例、45～＜55歲14例。本中心2013年5～7月的獻(xiàn)血者共計(jì)22639人次，按血型分A型7172人次、B型5629人次、O型7940人次、AB型1898人次；按性別分男12847人次、女9792人次。ABO 血型抗體降低的獻(xiàn)血者χ2檢驗(yàn)結(jié)果：A型與B型比較的P值為0.000，A型與O型比較的P值為0.000，B型與O型比較的P值為0.821；男性與女性比較的P值為0.001。

表1 PK7300儀器微板法測(cè)定抽樣樣本的ABO 血型抗體效價(jià)的頻數(shù)分布及均數(shù)

表2 儀器微板法及手工試管法測(cè)定各血型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)的凝集反應(yīng)情況

續(xù)表2 儀器微板法及手工試管法測(cè)定各血型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)的凝集反應(yīng)情況

3 討論

在疑難血型鑒定和輸血安全評(píng)估中通常會(huì)測(cè)定IgM 類血型抗體的效價(jià)，但傳統(tǒng)的試管法操作繁瑣、結(jié)果判讀易受操作者主觀因素的影響；用PK7300儀器微板法測(cè)定ABO 血型抗體（IgM 類）效價(jià)操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判讀客觀、重復(fù)性好。測(cè)定ABO 和Rh（D）血型時(shí)，PK7300吸樣后均在稀釋杯中對(duì)血球和血漿樣本進(jìn)行自動(dòng)稀釋后再加樣到微孔板與相應(yīng)的稀釋工作試劑進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，在廠家建議的參數(shù)設(shè)置中，血球樣本經(jīng)儀器自動(dòng)稀釋后的濃度為1.7%，血漿樣本經(jīng)儀器自動(dòng)稀釋后的稀釋倍數(shù)為1∶20。本研究顯示，盡管PK7300吸樣后在稀釋杯中對(duì)血漿樣本進(jìn)行1∶20自動(dòng)稀釋后再加樣到微孔板進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，但多數(shù)（24／30）抽樣標(biāo)本血漿在事先預(yù)稀釋5～80倍的條件下（總稀釋倍數(shù)則為100～1600倍）其凝集反應(yīng)仍能被儀器正確判讀，可見微板法具有較高的靈敏度；張悅等［4］研究亦表明，微板法的判讀正確率高于血站檢驗(yàn)科常用的手工紙片法。用PK7300測(cè)定抽樣樣本及混合血漿的ABO血型抗體效價(jià)時(shí)，將血漿標(biāo)本的稀釋比例范圍確定為1∶1～1∶80，該范圍能滿足絕大多數(shù)標(biāo)本的測(cè)定需要；采用梯度稀釋而非對(duì)倍稀釋，這樣有助于減小測(cè)定誤差，測(cè)得較為準(zhǔn)確的效價(jià)結(jié)果。

對(duì)比本研究中儀器微板法與兩種手工試管法測(cè)定各血型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)的凝集反應(yīng)情況可以看出，手工試管法的靈敏度明顯優(yōu)于儀器微板法，而手工試管法二的靈敏度又明顯優(yōu)于手工試管法一。目前，試管法、玻片法、瓷板法、紙片法、微板法、凝膠卡法、聚合酶鏈反應(yīng)法等多種方法可用于ABO 血型定型，但經(jīng)典的試管離心法仍被認(rèn)為是最可信賴的ABO 定型方法［5－7］。臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程有關(guān)試管法ABO血型鑒定中要求正定型標(biāo)本紅細(xì)胞或反定型試劑紅細(xì)胞的濃度為5%［3］；本研究中所用的試劑紅細(xì)胞（購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司），廠家說明書中未標(biāo)明其具體濃度，據(jù)推算其濃度約為2.5%；在本研究有關(guān)手工試管法測(cè)定各血型混合血漿的ABO 血型抗體效價(jià)的部分，作者在臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程的基礎(chǔ)上對(duì)試劑紅細(xì)胞的濃度以及血漿與試劑紅細(xì)胞的比例進(jìn)行了調(diào)整，試驗(yàn)結(jié)果表明，試管法二（約2滴標(biāo)本血漿加1滴2.5%試劑紅細(xì)胞的比例）具有更高的靈敏度，也更便于觀察判定凝集反應(yīng)情況，從而有助于減少因ABO 血型抗體效價(jià)降低而導(dǎo)致的抗體漏檢。在使用PK7300對(duì)獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行血型篩查檢測(cè)時(shí)，如遇到正反定型不符等可疑結(jié)果時(shí)，用試管法進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)有助于及時(shí)確定標(biāo)本血型、及時(shí)發(fā)布檢測(cè)報(bào)告。

本文表1中計(jì)算的效價(jià)幾何均數(shù)及算術(shù)均數(shù)與表2中儀器微板法測(cè)定的混合血漿的效價(jià)進(jìn)了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)值呈遞增關(guān)系，而算術(shù)均數(shù)與混合血漿的效價(jià)更接近。說明抗體效價(jià)的幾何均數(shù)主要是針對(duì)人群的集中趨勢(shì)而言，而不是人群或個(gè)體的平均水平。作者分別用兩種統(tǒng)計(jì)方法（將效價(jià)值取對(duì)數(shù)后進(jìn)行t檢驗(yàn)及直接將效價(jià)值進(jìn)行秩和檢驗(yàn)）對(duì)儀器微板法測(cè)定A、B、O 3種血型抽樣標(biāo)本的ABO 血型抗體效價(jià)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，所抽樣的O型獻(xiàn)血者的ABO 血型抗體效價(jià)高于A型或B型；但兩種統(tǒng)計(jì)方法的結(jié)果存在一定差異，作者認(rèn)為抽樣標(biāo)本量較少可能是導(dǎo)致這種差異最主要的原因。

標(biāo)本血漿的ABO 血型抗體（IgM 類）效價(jià)降低是導(dǎo)致PK7300不能正確判讀標(biāo)本血型（因正反定型不符）的最常見原因之一。本中心2013年5～7月因標(biāo)本血漿的ABO 血型抗體效價(jià)降低所導(dǎo)致的PK7300不能正確判讀標(biāo)本血型，則是A型明顯多于B型或O型，男性明顯多于女性；因未獲得不同年齡組獻(xiàn)血人群的整體數(shù)據(jù)，本研究未對(duì)不同年齡組間血型抗體效價(jià)降低的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但結(jié)合本研究中抗體效價(jià)降低的例數(shù)及文獻(xiàn)［8－9］有關(guān)獻(xiàn)血人群年齡分布特征的調(diào)查結(jié)果，可以推斷隨著獻(xiàn)血者年齡的增大，血型抗體效價(jià)降低者所占的比例體現(xiàn)出一定的增高趨勢(shì)，與文獻(xiàn)［5］中年齡因素對(duì)ABO 血型抗體水平的影響相符。需要提醒的是，對(duì)于ABO 血型抗體減弱的樣本，除生理因素外，有部分是A／B亞型；如A（？）B含抗－A1抗體，其反定型與A1C反應(yīng)較弱，正定型也可能只檢出B抗原，定型結(jié)果為B型，正反定型相符；此處檢出較弱的抗－A抗體，另外卻漏檢了A（？）抗原，導(dǎo)致正反定型偽相符，這種情況則需要進(jìn)一步做有關(guān)亞型檢測(cè)的相關(guān)試驗(yàn)予以確認(rèn)［10－11］。

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