綿陽地區食管鱗癌患者人乳頭瘤病毒感染及基因型別分析

謝東，羅一富（四川省綿陽市鹽亭縣人民醫院檢驗科 621600）

食管癌是人類消化道常見腫瘤，其發生、發展涉及多因素、多階段的復雜過程，但具體發病機制尚不明確［1－2］。人乳頭瘤病毒（HPV）是一類主要寄生于鱗狀上皮層的DNA 病毒，是第1個被確定為致瘤的病毒［3］。有關HPV 感染與食管鱗癌發生相關的研究正成為熱點，本研究旨在調查綿陽地區食管鱗癌中的HPV 感染狀況及具體基因型別，探討本地區HPV 感染與食管鱗癌發生是否相關。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇本院2010～2013年食管癌住院患者114例作為試驗組，其中男71例，女43例，年齡43～71歲，中位年齡58歲。病例納入標準：（1）病例資料記錄完整，且全部經病理組織學確診為鱗狀細胞性食管癌，其中高分化鱗癌38例，中分化鱗癌47例，低分化鱗癌29例；（2）初治患者，術前未接受任何化療或放療；（3）無合并其他部位的腫瘤。另選同期食管良性疾病患者52例作為對照組，其中男28例，女24例，年齡38～68歲，中位年齡53歲。食管黏膜大致正常27例，反流性食管炎16例，食管息肉9例。所有組織標本常規10%甲醛固定，石蠟包埋。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑與儀器 HPV 基因分型檢測試劑盒（表面等離子諧振法），W2600型生物傳感芯片閱讀儀均為北京金菩嘉醫療科技有限公司產品；石蠟組織標本DNA 提取試劑盒TaKaRa Dexpat為大連寶生物公司產品。

1.3 方法

1.3.1 組織切片DNA 提取石蠟包埋組織常規切片，厚度10μm，取切片3枚放入1.5mL 微量管，使用TaKaRa組織標本DNA 提取試劑盒提取組織切片DNA，試驗過程嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.3.2 HPV 檢測及基因分型采用金菩嘉HPV 基因分型檢測試劑盒（表面等離子諧振法，SPR）檢測24種HPV 基因型（高危型16種：16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，81；低危型8種：6，11，40，42，43，44，54，70）：提取的組織切片DNA 使用聚合酶鏈反應（PCR）擴增HPV 基因片段，然后將PCR 產物與雜交液按一定比例混合后，注入SPR 生物傳感芯片閱讀儀（W2600型），使其流過表面包被有24種HPV基因型特異性探針的SPR 生物傳感芯片，與芯片表面HPV 基因型特異探針反應，芯片閱讀儀檢測芯片上的雜交信號，數據通過軟件分析后可直接判斷結果，從而同時對HPV 的24種基因型進行檢測。

1.4 統計學處理采用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料以表示，符合偏態分布的數據，率的比較使用χ2檢驗，相關分析使用Spearman 等級相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和試驗組患者HPV 感染率比較試驗組患者HPV 檢出率（40.4%）明顯高于對照組（5.8%），差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 對照組和試驗組患者HPV 檢出率比較（n或%）

2.2 不同分化程度食管癌HPV 感染率的比較食管鱗癌中HPV 感染的陽性率在不同病理分級中的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 HPV 感染與食管癌病理分級的關系（n或%）

2.3 研究對象中HPV 基因分型檢測結果對114例食管鱗癌和52例對照共計166份組織標本進行了HPV 基因分型檢測，結果顯示：HPV 感染基因型從高到底依次為16、18、58、6、31、33、35、51、11型，食管鱗癌感染HPV 主要的基因型為16（23／114）、18（10／114）型，在食管鱗癌HPV 陽性病例中混合感染10例占21.7%，16型混合感染7例占15.2%（7／46），18型混合感染3例占6.52%。

3 討論

食管癌是人類消化道常見腫瘤，現有研究認為食管癌的發生和發展是一個涉及多因素、多階段的復雜過程［4］，其確切的病因及發病機制尚不明了，1982年Syrjanen對60例食管癌進行組織形態學觀察，發現約40%的食管扁平細胞癌病例中有HPV 感染的特征性改變——濕疣狀損傷，并且用免疫組織化學的方法證實了1例食管鱗癌中有HPV 抗原的存在，提出食管癌可能與HPV 感染有關，推測HPV 可能是該癌癥的危險因子，自此關于HPV 與食道癌疾病相關性的研究逐漸成為熱點［5－8］。

HPV 是一類主要寄生于鱗狀上皮層的小分子DNA 病毒，是第1個被確定為致腫瘤的病毒因素，HPV 與宮頸癌的密切關系已經得到驗證，HPV 在食管癌以及其他腫瘤中的作用尚存在爭議，但來自我國廣東、河北等食管癌高發區的檢測結果先后證實了這些地區的食管癌患者中存在相當普遍的HPV病毒感染。不同國家與地區研究報道的食管癌中HPV 的檢出率差異極大，從0%～70%不等，在探討食管癌中HPV 檢出率的巨大差異時，除了地理因素、環境因素及種族差異的影響外，所采用檢測方法的敏感性、特異性及不同的方法學操作也不容忽視。在本研究中，采用PCR 與表面等離子諧振芯片核酸雜交相結合的方法首次對綿陽地區114例食管鱗癌和52例食管良性疾病患者共計166份組織標本進行了HPV 檢測，SPR 是利用在金屬膜／液面界面，由光的全反射引起的物理光學現象來分析分子間相互作用的技術，其無需任何放射性或熒光物質標記樣品，能保持分子活性，并可避免由于標記問題產生的結果偏差，能實時、動態地監測生物分子相互作用的全過程，具有高特異性和高靈敏度，且重復性好。在114例食管癌中檢出HPV 陽性46例，檢出率為40.4%，明顯高于對照組的檢出率5.8%（3／52），差異有統計學意義（P＜0.05）。提示在綿陽地區HPV 的感染，同食管鱗癌發病存在相關，HPV 感染可能是本地區食管鱗癌發病的危險因素。

隨著對HPV 研究的不斷深入，人們認識到一些特定的HPV型別與人體特定部位的病變有關，且不同疾病可由同一種或多種HPV型別引起［10］。目前已發現的HPV 類別超過200種，其中120多種基因型被鑒定，約40余種基因型可感染生殖道等黏膜上皮組織，根據其致癌性大小則可分為低危型（如HPV－6、11、42、43等）和高危型（如HPV－16、18、58、35等），低危型主要引起表皮細胞良性增生，而高危型HPV 則與生殖道、皮膚、頭和頸部以及喉部等的鱗狀細胞惡變有關［9－10］。在HPV 與宮頸癌的眾多研究中表明，HPV 在不同地區感染率和分型均有明顯的差異，對HPV 進行分型研究具有重要意義。本研究對綿陽地區食管鱗癌患者組織標本進行HPV 檢測的同時進行了HPV 基因分型，結果顯示：本組標本中HPV感染基因型從高到底依次為16、18、58、6、31、33、35、51、11型，食管鱗癌感染HPV 主要的基因型為16（23／114，20.2%）、18（10／114，8.8%）型，在食管鱗癌HPV 陽性病例中混合感染10例（21.7%），16型混合感染7例（15.2%），18型混合感染3例（6.52%），感染的主要亞型及感染方式與國際癌癥研究協會報道相符合，HPV16／18亞型可能為本地區HPV 相關食管鱗癌發病的主要危險因素及主要的致瘤因素。HPV 雖然與食管鱗狀上皮惡化具一定相關性，但在本研究中其與食管癌的病理分級不存在相關（P＞0.05）。

綿陽地區并不是傳統意義上的食管癌高發區，但隨著生活習慣、生存環境等等的改變，本地區食管癌的發病率及病死率已成上升態勢，本研究提示HPV 感染可能和綿陽地區食管癌的發生存在相關，可能是本地區食管鱗癌發病的危險因素之一，但尚不能反映整個地區食管癌中HPV 的感染情況，最終確定本地區HPV 感染與食管癌的關系，還需要進行大量的實驗室基礎研究和流行病資料調查，對大規模健康人群及典型人群進行長期追蹤隨訪，以期從環境、基因、病毒等多方面探討HPV 感染與食管鱗癌發生、發展的具體聯系。

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