四環素調控HSV－tk基因在HeLa細胞內表達及抗腫瘤作用

王 茜，杜珍武，馬青山，張桂珍＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院 腎病內科，吉林 長春130033；2.吉林大學第二醫院 中心研究室，吉林 長春130041；

3.吉林大學第一臨床學院 兒科，吉林 長春130031）

單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因為腫瘤治療常用的自殺基因之一，其可將細胞內無毒的前體藥物無氧鳥苷（GCV）轉變成有毒性的藥物，進而殺傷腫瘤細胞[1，2]。研究表明此類自殺基因在體內的過量表達，可損傷機體組織器官，因此調控該基因在體內的表達水平十分重要[3－5]。

四環素基因表達調控系統為較常用的基因表達調控系統[6，7]，本研究擬在構建四環素調控 HSV－tk基因表達系統的基礎上[8，9]，探討應用四環素調控HSV－tk基因在HeLa細胞內表達及其抗腫瘤作用，為HSV－tk基因可調控性治療腫瘤研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法1.1 主要材料

pcDNA6／TR 質粒載體 、pcDNA3.1（＋）質粒載體、pcDNA3.1－TetO2－TKI質粒載體（含四環素反應元件與HSV－tk基因）及HeLa細胞株由本院中心實驗室提供；胎牛血清；DMEM培養基（高糖）；Trizol試劑；RT－PCR試劑盒；GCV、MTT、G418、強力霉素、殺稻瘟素；Attractene transfection reagent轉染試劑盒；

1.2 方法

HeLa細胞培養、基因轉染和基因表達檢測、強力霉素調控HSV－tk基因殺傷HeLa細胞，操作按參考文獻[8，9]進行。

2 結果

2.1 RT－PCR檢測TR基因在HeLa細胞內表達結果

RT－PCR檢測結果表明，未轉染pcDNA6／TR質粒及轉染質粒pcDNA3.1的HeLa細胞未檢測到TR基因表達，而穩定轉染pcDNA6／TR質粒的HeLa－TR細胞檢測到TR基因的表達（見圖1）。

2.2 RT－PCR檢測強力霉素調控 HSV－tk基因在HeLa細胞內表達結果

穩定轉染 TR 和 HSV－tk的 HeLa－TR－TetO2－TKI細胞，經過不同濃度的強力霉素作用48h后，其HSV－tk基因表達的RT－PCR結果顯示：隨著強力霉素濃度的增大，基因表達的量增加。強力霉素濃度4μg／ml時與 HeLa－TetO2－TKI細胞內 HSV－tk表達水平相當，說明此濃度強力霉素調控基因的表達水平達到了高峰（見圖2）。

2.3 Dox調控 HeLa－TR－TetO2－TKI細胞對 GCV的敏感性

將 Dox（4μg／ml）分別加入 HeLa－TR－TetO2－TKI細胞及 HeLa－TetO2－TKI細胞，48h后給予不同濃度的GCV，72h后用 MTT法測定細胞存活率，判定GCV對各組細胞殺傷的敏感性。結果顯示：未加Dox時，HeLa－TR－TetO2－TKI細胞對各濃度GCV的細胞殺傷不敏感，而加入Dox后，該細胞對各濃度GCV的細胞殺傷敏感，其50%生存率時GCV濃度為10μg／ml；無論Dox是否存在，HeLa－TetO2－TKI細胞對GCV的細胞殺傷均敏感，其50%生存率時GCV濃度為5μg／ml左右，見圖3。

3 討論

圖1 RT－PCR檢測TR基因在HeLa細胞內表達

圖2 強力霉素調控 HeLa－TR－TetO2－TKI細胞內HSV－tk基因表達的RT－PCR電泳圖

圖3 Dox調控 HeLa－TR－TetO2－TKI細胞對GCV的敏感性

四環素調控的基因表達系統是利用大腸桿菌Tn10特異的四環素抗性操縱子原理建立的基因表達調控系統，屬于負調控作用方式[10，11]，由兩部分組成：調控部分，表達四環素調控的阻遏蛋白；操縱部分，由四環素反應元件及目的基因組成。基本調控過程如下：調控部分表達的阻遏蛋白TetR和操縱部分的四環素反應元件結合后，抑制了目的基因表達；而加入四環素后，四環素與TetR結合，導致TetR與四環素反應元件脫離，目的基因得以表達。本研究根據上述四環素調控基因表達的原理，應用雙載體系統以及四環素類似物強力霉素調控HSV－tk基因在HeLa細胞內表達。實驗結果表明：穩定轉染四環素阻遏蛋白基因以及四環素反應元件及HSV－tk基因的HeLa細胞，未給予四環素類似物時，用RT－PCR方法檢測 HSV－tk基因無表達；給予四環素類似物后，隨著藥物濃度的增大，HSV－tk基因表達升高。說明四環素可通過該雙載體系統，有效地在體外調控HSV－tk基因在HeLa細胞內表達，同時調控了HSV－tk／GCV系統對HeLa細胞的殺傷作用。本研究應用四環素基因表達系統成功地調控了HSV－tk基因在HeLa細胞表達及其腫瘤殺傷功能，為探討自殺基因殺傷腫瘤的可調控性提供理論基礎。

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