慢病毒介導Shh基因轉染對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學性狀的影響

邊學海，徐為然，張 廣，張純海，周 樂，李世杰，孫 輝

（1.吉林大學中日聯誼醫院 甲狀腺外科，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫院 內鏡中心）

Sonic hedgehog信號通路涉及到腫瘤細胞的生長、凋亡、轉移等多個方面[1－3]。該通路的啟動信號Shh蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌（PTC）組織中的表達增高，并與分期及淋巴結轉移有關，提示Shh可能促進PTC細胞的增殖和轉移[4，5]。已構建的pGC－FU－Shh－GFP慢病毒載體可成功轉染PTC原代細胞，并穩定過表達Shh[6]。我們用Shh慢病毒載體轉染過表達Shh基因，觀察對PTC細胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響，及Sonic hedgehog通路相關基因表達變化，試圖為PTC提供潛在的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗用PTC原代細胞由吉林大學基礎醫學院組織胚胎學系提供[7]。慢病毒載體pGC－FU Vector，293T（GENECHEM，上 海），Lipofectamine 2000（Invitrogen），Polybrene病毒感染試劑（Sigma），dNTP（Takara），250bp DNA ladder Marker（捷瑞）。根據GenBank中人Shh基因序列（NM＿000193.2）采用軟件Primer 3設計，Shh基因序列上游引物Shh－F：GGGTTCGGGAAGAGGAGGCA，下游引物 Shh－R：TCGGTCACCCGCAGTTTCA，擴增條帶293bp。ShhDNA片段PCR擴增和鑒定委托上海GENECHEM公司完成。

1.2 PTC細胞轉染 分為兩組：實驗組（轉染慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表達載體）；陰性對照組（轉染空載體慢病毒陰性對照載體）。轉染前1d將生長狀態良好的PTC細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔接種5×105個細胞，隨后按慢病毒轉染細胞步驟進行。取慢病毒轉染效率在80%以上的目的細胞進行實驗。

1.3 MTT試驗 調整PTC細胞密度為1×107個／L。鋪4個96孔板，每孔2000個細胞。待細胞貼壁后，取0h、24h、48h、72h后的樣品，每孔加入10μl MTT溶液，繼續孵育4h。在490nm波長處測定吸光度（OD值）。以OD值為縱坐標，時間點為橫坐標，繪制兩組細胞的生長曲線，對比兩組細胞的生長情況。

1.4 檢測細胞周期 分別收集Shh－PTC細胞與陰性對照組細胞，離心、洗滌重復2次后加入1ml的4℃預冷后的70%乙醇固定，經流式細胞儀檢測分析，得出細胞周期各時相的比例。

1.5 Transwell細胞遷移實驗 用孔徑8μm聚碳酸酯膜的Transwell小室，調整PTC細胞密度為1×107個／L。按遷移實驗步驟進行。顯微鏡下取15個視野，觀察計算平均數。

1.6 轉染前后Shh通路相關基因表達檢測 根據GenBank中人SMO基因序列（NM＿005631.4），Gli1基因序列（NM＿0001160045.1）及PTCH基因序列（NM＿000264.3）設計引物并合成。按 mRNA及蛋白檢測步驟，對PTC細胞在轉染前后SMO、Gli1、PTCH mRNA及蛋白表達進行檢測。

1.7 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，采用χ2檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05為有統計學意義，P＜0.01為有十分顯著的統計學意義，P＞0.05為無統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒載體轉染PTC細胞的效率 按轉染慢病毒載體與細胞數量比值MOI＝20轉染人PTC細胞48h、96h后，分別觀察可見強綠色熒光顆粒，轉染效率約為80%，細胞生長狀態良好，表明轉染條件穩定，細胞轉染成功，可以用于后續的實驗。

2.2 Shh對PTC細胞增殖的影響 MTT法檢測細胞的密度（OD）值繪制細胞的生長曲線，結果顯示實驗組生長曲線陡直，細胞生長速度較陰性對照組顯著提高（P＜0.05），提示Shh的過表達有潛在促進PTC細胞增殖的作用。見圖1。

圖1 各組細胞不同時間的生長曲線

流式細胞檢測細胞周期發現：與陰性對照組細胞相比，Shh－PTC細胞24h后S期上升至20.88%；Shh－PTC細胞48h后G1期上升至83.78%，結果提示：Shh－PTC組G1、S期相對陰性對照組增高，轉染Shh基因后的PTC細胞增殖較快。

2.3 Shh對PTC細胞遷移的影響 遷移至下室的細胞數目在實驗組15個視野共511個細胞，每個高倍鏡（400×）視野平均34個細胞；陰性對照組15個視野共323個細胞，每個高倍鏡（400×）視野平均22個細胞，見圖2。兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）。與陰性對照組比較，實驗組穿透濾過膜細胞數量明顯增加。結果提示過表達Shh明顯增強人PTC細胞的遷移運動能力。

2.4 轉染后兩組細胞Shh mRNA和Shh蛋白的表達水平

Realtime－PCR檢測細胞中Shh mRNA的表達，實驗組PTC細胞Shh mRNA表達水明顯高于陰性對照組（P＜0.05），提示慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表達載體對PTC細胞的Shh基因過表達有效。見圖3。

Western blotting檢測實驗組PTC細胞Shh蛋白的表達水平明顯高于陰性對照組（P＜0.05），提示慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表達載體轉染PTC細胞后，Shh蛋白的表達增多，與Realtime－PCR結果一致。

圖2 細胞的遷移活力（400×）

圖3 FQ－PCR（2－△△Ct方法）檢測兩組細胞Shh mRNA的相對表達量

2.5 轉染后Sonic hedgehog通路相關的基因SMO、Gli1、PTCH蛋白表達水平明顯提高。Western blotting檢測結果顯示，與陰性對照組相比過表達Shh基因的PTC細胞SMO、Gli1、PTCH 3種蛋白的表達都有所升高，實驗組SMO表達是陰性對照的1.154倍，Gli1是陰性對照組的1.062倍，PTCH是陰性對照組的1.205倍。見圖4。

圖4 Sonic hedgehog通路相關蛋白表達變化

3 討論

Shh蛋白屬于分泌型信號蛋白，作為Sonic hedgehog信號通路的啟動信號，通路過程將信號轉導至細胞內，轉錄因子Gli蛋白家族激活下游靶基因，使細胞發生一系列病理、生化等方面變化。研究結果，Sonic hedgehog信號通路途徑的反常在惡性腫瘤的生長和維持中起到重要作用。本研究采用慢病毒載體pGC－FU－Shh－GFP轉染PTC細胞，穩定過表達Shh蛋白，觀察Shh穩定過表達后PTC細胞生物學性狀的變化。結果顯示，Shh穩定過表達后，PTC細胞表現出了較強的細胞增殖能力，使細胞周期G1期上升，提示Shh可能在PTC中參與了其增殖過程。細胞遷移實驗結果提示過表達Shh明顯增強人PTC細胞的遷移運動能力，初步提示Shh可能參與了PTC轉移的過程。Shh過表達后，Sonic hedgehog信號通路中關鍵基因SMO、Gli1、PTCH mRNA和蛋白表達水平均明顯提高，驗證了PTC細胞該傳導通路激活過程，符合以往的文獻報道。目前研究對于信號增強后變異細胞的鑒別，對于該信號蛋白如何調節腫瘤惡性，尤其對Gli蛋白家族的下游靶基因研究較少，也是我們亟待解決的問題。

本研究證實在PTC的發生、發展中Sonic hedgehog通路激活是激發或促進因素，可能促進腫瘤細胞的生長、轉移。Shh可能為PTC預后判斷指標及潛在的治療靶點，尤其可能在進展期PTC患者治療中起到作用。推測Shh缺乏膽固醇修飾，可能會抑制遠程信號傳遞作用；作用靶點為SMO蛋白的信號通路小分子抑制劑環王巴明，可能在進展期PTC患者治療中起到作用。

[1]Kasper M，Regl G，Frischauf AM，et al.GLI transcription factors：mediators of oncogenic hedgehog signaling[J].Euro J Cancer，2006，42（4）：437.

[2]Rubin LL，De Sauvage FJ.Targeting the Hedgehog pathway in cancer[J].Nature，2006，5（12）：1026.

[3]江 穩，陳錫林，丁 詠，等.Hedgehog信號傳導通路相關基因在腫瘤組織中的表達及其特異性抑制劑Cyclopamine對增殖、凋亡的影響[J].中華實驗外科雜志，2010，27（5）：651.

[4]Nelson KK，Gattuso P，Xu X，et al.Expression of the Sonic Hedgehog pathway molecules in synchronous follicular adenoma and papillary carcinoma of the thyroid gland in predicting malignancy[J].Central Surgical Association，2010，148（4）：654.

[5]邊學海，張 廣，張純海，等.甲狀腺乳頭狀癌組織中Shh和Gli1的表達及其臨床意義研究[J].國際外科學雜志，2011，38（2）：78.

[6]邊學海，趙吉生，徐為然，等.人Shh基因重組過表達慢病毒載體的構建與鑒定[J].中國實驗診斷學，2013，17（11）：1970.

[7]邊學海，趙吉生，張秀英，等.人甲狀腺乳頭狀癌原代細胞的體外長期培養[J].中國普外基礎與臨床雜志，2011，18（8）：840.