支氣管鏡活檢小標本檢測DNA含量對肺癌的診斷價值

錢文霞+陳麗秀+朱敏鋒+王姝

【摘要】 目的：探討對纖維支氣管鏡活檢小標本行流式細胞儀DNA含量分析對于肺癌診斷的臨床價值。方法：通過篩選2010年4月-2011年4月于本院呼吸內科行纖維支氣管鏡檢患者，以30例肺癌患者及35例肺部良性病變患者為研究對象，采用流式細胞術進行DNA含量分析，對比分析兩組間DI、異倍體率、SPF、PI的差異，評價其對于肺癌診斷的臨床價值。結果：肺癌患者的DI值、異倍體率、SPF及PI均較肺部良性病變患者顯著升高（P<0.05）；病理組織學檢查、DNA含量分析、細胞學檢查對于肺癌檢測陽性率分別為80.0%、73.3%、43.3%，DNA含量分析、病理組織學檢查對于肺癌的診斷陽性率顯著高于細胞學檢查（P<0.05），而DNA含量分析與病理組織學檢查結果無顯著差異（P>0.05）；此外，采用兩者聯合檢測可進一步提高檢出陽性率，可達90.0%。結論：肺癌患者腫瘤組織內DNA含量顯著高于正常組織，采用流式細胞術進行DNA含量分析，對于肺癌診斷有一定的臨床價值。

【關鍵詞】 肺癌； 支氣管鏡； 流式細胞術； DNA含量分析； 診斷

The Diagnosis Value of DNA Content of the Small Specimens from Bronchoscopic Biopsy on Lung Cancer/QIAN Wen-xia，CHEN Li-xiu，ZHU Min-feng，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：019-021

【Abstract】 Objective：To investigate the diagnosis value of DNA content of the small specimens from bronchoscopic biopsy on lung cancer.Method：30 patients with lung cancer and 35 patients with benign lung disease，which received fiberoptic bronchoscopy，were selected as the research object in our hospital during April 2010 to April 2011， and then DNA content was detected by using flow cytometry to analyze thedifference of DI， aneuploidy rate，SPF，PI between the two groups and to evaluate its clinical value for the diagnosis of lung cancer. Result：The DI，aneuploidy rate，SPF，PI of lung cancer patients were significantly higher than that in the patients with benign lung lesions（P<0.05），the positive rate for lung cancer detection using histopathological examination，DNA content analysis，cytology were 80.0%，73.3%，43.3%，respectively.The positive rate by DNA content analysis and histopathological examination were significantly higher than cytology（P<0.05）， while the DNA content analysis and histopathological examination showed no significant difference（P>0.05）.In addition，the positive rate by combined detection can be further increased up to 90.0%.Conclusion：DNA content in the tumor tissue of lung cancer are significantly higher than that in normal tissue， DNA content analysis by flow cytometry has an important clinical value for the diagnosis of lung cancer.

【Key words】 Lung cancer； Bronchoscopy； Flow cytometry； DNA content analysis； Diagnosis

First-authors address：The Affiliated First Peoples Hospital of Suzhou University in Zhangjiang City，Zhangjiagang 215600，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.007

肺癌是較為常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著環境污染的加劇以及社會、生活壓力的增加，其發病率呈現上升趨勢，且較難治愈，5年生存率僅為10%～15%[1]。目前，臨床對于肺癌的早期診斷率僅為15%，但經早期診斷的患者其5年生存率可達60%～90%，提示加強肺癌早期診斷，及早救治，對于肺癌患者的治療具有良好的促進作用，顯著改善患者預后，提高其生活質量[2-3]。多項研究表明，惡性腫瘤細胞多表現為染色體異常，如染色體結構改變、數目減少/增加等，因此，異倍體出現往往惡性腫瘤的特征之一，而染色體的異常也使得腫瘤細胞內DNA含量改變，此外，DNA水平的改變早于細胞形態學變化發生，從而使其成為可能的惡性病變早期診斷的指標[4-5]。本研究通過篩選2010年4月-2011年4月于本院呼吸內科行纖維支氣管鏡檢患者，以30例肺癌患者及35例肺部良性病變患者為研究對象，采用流式細胞術進行DNA含量分析，對比分析其對于肺癌診斷的臨床價值。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年4月-2011年4月于本院呼吸內科行纖維支氣管鏡檢的患者356例為研究對象，經檢查65例患者疑有支氣管新生物、黏膜病變，后病理組織學確診發現，肺癌30例，肺部良性病變35例。其中，30例肺癌患者中，男21例，女9例，年齡43～76歲，平均（62.7±12.3）歲；35例肺部良性病變患者中，男24例，女11例，年齡42～75歲，平均（61.0±10.7）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 支氣管纖維鏡檢查 纖維支氣管鏡檢查采用日本奧林巴斯公司生產的BF-P40纖維支氣管鏡及成像系統進行，具體操作如下：常規術前準備，與患者交流溝通并詳細掌握患者的臨床資料，如近期X線胸片、CT結果等，確定患者的病變部位；霧化吸入2%利多卡因行鼻腔、口咽部局部麻醉，經鼻腔置入支氣管鏡；于可疑病變處，如支氣管新生物，黏膜僵硬、肥厚、水腫、潰瘍，支氣管外壓性狹窄、閉塞等，即在病變部位選擇3～5處鉗取組織，并在活檢部位刷檢。所取樣本按要求置于含有10%中性福爾馬林、70%乙醇標本瓶內，分別用于病理檢查及流式細胞儀檢測[6]。

1.2.2 常規病理學檢查 常規病理學檢查選取采用10%中性福爾馬林固定的樣本，進行脫水及石蠟包埋并切片，厚度約為4 μm，每組樣本切片6～8張，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色），或采用特異性免疫組織化學標記[7]。所有患者的病理檢查及診斷均由臨床經驗豐富的同一病理醫師進行，并由另外一位醫師進行復查，以確保診斷的準確性。

1.2.3 流式細胞術DNA含量分析 對于DNA含量分析，儀器選用美國BD 公司生產的FACS Calibur流式細胞儀，具體操作如下：取支氣管鏡活檢樣本約0.5 g，采用眼科剪將其剪碎至1 mm3大小，180目銅網過濾，PBS緩沖液沖洗，制備單細胞懸液；1000 r/min離心5 min，除去上清，加入溶血素2 mL重懸細胞并放置10 min，PBS緩沖液洗滌3次；1000 r/min離心5 min，除去上清，加入95%冰乙醇至終濃度為70%的細胞懸液固定，待檢。上機檢測時，分別依次加入A溶液250 μL（內含30 mg/L胰蛋白酶）、B溶液200 μL（內含100 mg/LRNase A）、C溶液200 μL，各溶液加入后靜置作用10 min，并調整細胞濃度為106。檢測至少收集105個細胞，獲取DNA直方圖[8]。

1.3 觀察指標 DNA含量采用DNA指數（DI值）表示，DI=（腫瘤細胞G0/G1峰道數）/（正常二倍體細胞G0/G1期峰道數），根據DI值的差異判定DNA倍體[9]，其中，0.91.1外，還需觀察DNA直方圖是否出現雙峰及異倍體細胞群是否含有5%～10%的細胞或核；測定患者DNA合成期細胞比率（SPF）及細胞增殖指數（PI），以SPF>15%、PI>20%為細胞增殖異常。其中，SPF（%）=[S÷（G0/G1+S+G2M）]×100%；PI=（S+G2M）/（G0/1+S+G2M）。

1.4 統計學處理 所有數據均采用SPSS 19.0統計學軟件進行處理分析，其中計量資料以（x±s）表示，組間對比行t檢驗；計數資料采用百分率表示，組間對比行 字2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌及肺部良性病變患者DNA含量分析 對65例疑患有支氣管新生物、黏膜病變者行流式細胞術DNA含量分析發現，肺癌患者的DI值、異倍體率、SPF及PI均較肺部良性病變患者顯著升高，組間對比差異具有統計學意義（P<0.05），具體見表1。

表1 肺癌及肺部良性病變患者DNA含量分析

2.2 DNA含量分析與病理檢查、細胞學檢查的結果比較 分別采用病理檢查、細胞學檢查及流失細胞儀DNA含量分析進行肺癌診斷發現，細胞學檢查檢出肺癌患者13例，陽性率為43.3%；病理組織學檢查檢出肺癌患者24例，陽性率為80.0%；DNA含量分析結果顯示，22例診斷為肺癌，陽性率為73.3%。此外，3例DNA含量分析異常者，經病理學檢查表現為炎性組織，采用兩者聯合檢測可進一步提高檢出陽性率，可達90.0%。組間對比發現，DNA含量分析、病理組織學檢查對于肺癌的診斷陽性率顯著高于細胞學檢查， 字2值分別為5.554、8.531，P值分別為0.018、0.003，而DNA含量分析與病理組織學檢查結果差異無統計學意義（ 字2=0.373，P=0.542）。

3 討論

隨著生物學及醫學研究的不斷深入，對于腫瘤細胞的基因組學、蛋白質組學等分子水平研究逐漸明晰，這也使得腫瘤細胞的診斷方法逐漸增加，腫瘤細胞DNA含量異常，易出現異倍體。有報道發現，91%的惡性腫瘤為異倍體，而良性腫瘤及良性病變細胞DNA含量多為二倍體，使其成為腫瘤診斷的標志物[10]。肺癌是臨床較為常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率較高，且呈上升趨勢，嚴重威脅患者的生活質量和生命安全。研究顯示，早期診斷對于肺癌患者的治療及預后有著重要作用，可大大提高患者的生存率[11]。因此，如何及早診斷、及早治療肺癌，成為臨床醫學亟待解決的重要問題。

有研究報道，采用流式細胞術對肺癌患者的腫瘤組織、正常肺組織及癌旁組織進行DNA含量分析發現，正常肺組織細胞的DNA含量均為二倍體，而肺癌組織細胞DNA含量異常，異倍體率高達74.4%，提示檢測DNA含量，計算異倍體率可有效檢測肺癌的發生[12]。譚焰等[13]通過對周圍型肺癌及肺良性病變患者行DNA含量分析發現，其對于周圍型肺癌的診斷敏感性、特異性分別為67.7%、95.0%，顯著高于較活檢和刷檢的陽性率，表明支氣管肺泡灌洗液細胞DNA含量分析能有效診斷周圍型肺癌。本研究通過對支氣管鏡活檢樣本行DNA含量分析發現，肺癌患者的DI值、異倍體率、SPF及PI均較肺部良性病變患者顯著升高，其異倍體率高達73.3%，而肺部良性病變患者僅為5.71%，與文獻[12]報道相符，提示DNA含量增加是惡性腫瘤的特征性指標。通過比較組織病理檢查、DNA含量分析及細胞學檢查的結果發現，三者對于肺癌診斷的陽性率分別為80.0%、73.3%、43.3%，DNA含量分析、病理組織學檢查對于肺癌的診斷陽性率顯著高于細胞學檢查，而兩者間無明顯差異。3例患者病理學檢查表現為炎性組織而漏診，而DNA含量分析為異倍體，表明DNA含量分析可作為病理學檢查的輔助項目，用于一些形態學檢查難以診斷的病例，從而提高腫瘤診斷效率。

此外，有研究發現，腫瘤組織DNA含量、SPF及PI對于腫瘤生物學行為的改變有重要影響，DI、SPF、PI值越高，患者的生存期越短，SPF、PI值是反映細胞增殖及侵襲能力的指標，其值升高，表示異倍體腫瘤細胞的增殖活性增強，可在一定時間內可分裂更多次數，使腫瘤細胞數量顯著增加[14-15]。本研究也對比觀察異倍體及二倍體肺癌患者的SPF及PI，異倍體肺癌患者顯著升高。因此，采用流式細胞術檢測DNA含量不僅利于肺癌的早期診斷，同時可解釋、判斷惡性腫瘤的生物學行為，有利于預后判斷。

綜上所述，肺癌患者腫瘤組織內DNA含量顯著高于正常肺組織，采用流式細胞術進行DNA含量分析，對于肺癌診斷有一定的臨床價值，可作為病理檢查的輔助項目，有效提高肺癌診斷的陽性率，同時可反映腫瘤的生物學行為，利于預后判斷。

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（收稿日期：2014-04-23） （本文編輯：陳丹云）endprint