橋本甲狀腺炎患者殺傷細胞免疫球蛋白樣受體與人類白細胞抗原基因對頻率的分析①

李建婷 郭 成 侯巖峰 焦玉蓮 趙躍然 孫 慧 徐 進 曹銘鋒 高 聆 趙家軍 張海清 李明龍(山東大學附屬省立醫院內分泌科，濟南250021)

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)主要表達于自然殺傷細胞(Natural killer，NK)和部分T細胞表面，通過特異性識別靶細胞表面人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)，調控NK細胞和T細胞的免疫活性。HLA-C屬于經典的HLA-I類分子，廣泛分布于有核細胞表面，根據第80位氨基酸的不同，可將HLA-C分為HLA-C1(Asn80)和HLA-C2(Lys80)兩組。HLA-C1組包括 HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08，特異性識別 KIR2DL2/3和 KIR2DS2;HLA-C2 組包括 HLA-Cw02、Cw04、Cw05、Cw06，特異性識別KIR2DL1和KIR2DS1。兩組HLA-C配體分別與不同的KIR受體結合，影響機體自身的免疫穩態，導致疾病的發生［1-3］。

橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis，HT)是自身免疫甲狀腺病的一種，其發病機制可能與HT患者體內NK細胞和T細胞的免疫功能紊亂有關，但是具體機制尚未完全闡明。本研究旨在以往研究的基礎上，用序列特異性引物PCR(sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR-SSP)方法進一步分析KIR/HLA受體配體基因對的分布及其與HT發病間的關聯性。

1 材料與方法

1.1 試劑與引物 Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，dNTP購自上海生物工程技術服務有限公司。引物設計參照文獻［4，5］，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 研究對象的選擇 HT組選擇2012年10月至2013年3月就診于山東省立醫院的山東地區橋本甲狀腺炎患者44例，其中男1例，女43例，患者全部存在彌漫性甲狀腺腫大，實驗室檢查見甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)明顯升高，甲狀腺B超示符合橋本甲狀腺炎表現，甲狀腺細針穿刺細胞學檢查結果確診為HT，并排除其他甲狀腺及自身免疫性疾病。對照組為同期同地區無血緣關系的隨機健康個體43例，其中男1例，女42例，均排除甲狀腺疾病、自身免疫性疾病及相關家族病病史。HT患者組與對照組的年齡、性別分布經檢驗無統計學差異。

1.3 基因組DNA提取 空腹抽取外周靜脈血，ACD抗凝，用氯仿、飽和酚法提取DNA。

1.4 KIR基因分型分析 用序列特異性引物PCR方法進行KIR基因分型。測定的KIR基因包括抑制性 KIR:KIR2DL1、KIR2DL2/3，活化性 KIR:KIR2DS1、KIR2DS2以及框架基因 KIR2DL4。PCR反應體系20 μl，其中模板 DNA 100 ng，上、下游引物終濃度 0.2 μmol/L，10 × PCR buffer 2 μl，MgCl21.6 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，Taq DNA 聚合酶0.5 U，加 ddH2O 至20 μl。反應條件:96℃預變性 1 min，循環參數:96℃ 變性 25 s，65℃ 退火 45 s，72℃延伸30 s，進行5個循環;96℃變性25 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，進行21 個循環;96℃變性 25 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，進行5個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager TM2200生物圖像分析儀分析結果。每一個DNA模板的PCR擴增反應，以框架基因KIR2DL4作為PCR反應效率的內參照。

1.5 HLA-C基因分型分析 用序列特異性引物PCR方法進行HLA-C基因分型。測定的HLA-C基因為 HLA-Cw01-Cw08。PCR 反應體系20 μl，其中模板 DNA 100 ng，上下游引物終濃度 0.5 μmol/L，2 ×PCR buffer 10 μl，dNTP 0.25 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，加 ddH2O 至 20 μl。反應條件:96℃預變性7 min，循環參數:96℃變性 30 s，68℃退火 45 s，72℃延伸60 s，進行 5個循環;96℃變性 30 s，63℃退火45 s，72℃延伸30 s，進行21個循環;96℃變性30 s，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，進行 5 個循環;最后72℃延伸5 min。PCR產物處理同上。

1.6 統計學處理 應用SPSS18.0軟件包處理，患者組與對照組之間KIR/HLA-C基因對頻率顯著性差異采用四格表卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIR/HLA-C基因對頻率在兩組間的比較 分別比較HT患者組和健康對照組KIR2DL1+HLAC2、KIR2DL2/3+HLA-C1、KIR2DS1+HLA-C2 和KIR2DS2+HLA-C1四對KIR/HLA-C基因對的頻率(圖1)，四對基因對均以不同頻率表達，與對照組相比，HT患者組外周血中KIR2DS2+HLA-C1基因對頻率顯著升高(36.36%vs 16.28%，P ＜0.05)，其余3對基因對 KIR2DL1+HLA-C2、KIR2DL2/3+HLA-C1和KIR2DS1+HLA-C2在HT組和對照組頻率差異均無統計學意義。

2.2 各HLA-C基因頻率在兩組間的比較 分別比較 HLA-C1(HLA-Cw02、04、05、06)和 HLA-C2(HLA-Cw01、03、07、08)兩組 HLA-C 基因，兩組HLA-C基因在外周血中呈不平衡表達，其中HLACw03和HLA-Cw08基因在HT患者中頻率較健康對照者減低，兩組相比差異有顯著性(15.91%vs 40.70%，26.14%vs 47.67%，P 均 ＜0.05)。但是總的HLA-C1和HLA-C2頻率在兩組間無顯著性差異(表1)。

圖1 4對基因對在兩組人群中頻率的差異性比較Fig.1 Frequencies of four KIR/HLA-C gene-pairs in HT patients in comparison with healthy controls

表1HLA-C1和HLA-C2基因頻率比較Tab.1 Frequencies of HLA-C1 and HLA-C2 genes in patients compared with control subjects

3 討論

近年來，關于KIR基因與疾病間關系的研究屢見不鮮，越來越多證據表明，特定的KIR基因型在腫瘤、病毒感染、妊娠流產及自身免疫性疾病的發生發展中起重要作用［6-9］。根據我們之前的研究，KIR多態性與HT的發病相關，其中抑制性KIR基因KIR2DL5可能是HT發病的保護因子［10］。但是隨著研究的深入，研究者們發現在判斷KIR生物學效應時，應同時分析其與HLA配體的配對情況，KIR只有通過與特異性HLA配體結合才能發揮對NK細胞和T細胞免疫活性的調節作用。例如，單獨分析KIR頻率時，黑色素瘤患者和1型糖尿病患者的KIR頻率與正常人群相似;而分析KIR受體與HLA配體基因對時，發現黑色素瘤患者的抑制性KIR/HLA-C基因對頻率較正常人群低［11］，1型糖尿病患者活化性基因對頻率較正常人群高［12］。到目前為止，國內外有關HT患者KIR與HLA受體配體基因對的研究鮮有報道，因此，我們在以往研究的基礎上，又延伸了對HT患者和健康對照人群KIR/HLAC受體配體基因對頻率差別的研究。

我們應用PCR-SSP方法分析兩組人群間4對不同KIR/HLA-C基因對頻率的差別，結果顯示只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因對頻率在兩組人群中有顯著性差異，并且HT患者頻率明顯高于健康人群(36.36%vs 16.28%，P ＜ 0.05)，雖然 HLACw03和HLA-Cw08在兩組間有統計學意義，但是總體HLA-C1和HLA-C2頻率并沒有統計學差異，不能作為判定HLA-C基因有意義的標準。以往Faridi等［8］應用PCR-SSP方法研究了早期復發性流產患者的KIR和HLA基因組合，發現復發性流產患者KIR2DL1/HLA-C2基因頻率低于正常早孕婦女，而活化性KIR2DS2/HLA-C1基因頻率則明顯高于患者，表明抑制性和活化性KIR/HLA-C基因均可能與習慣性流產的發生有關。國內徐金娥等［13］做了類似的研究，結果發現只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因對頻率在兩組間有統計學意義，并且患者組頻率高于對照組。Yen等［9］用同樣的方法對類風濕性關節炎患者做了研究，發現患者KIR2DS2/HLA-C1基因對頻率較健康對照者高。HT、習慣性流產和類風濕性關節炎的發生均與自身免疫功能異常相關，以上研究結果均提示抑制性和(或)活化性KIR/HLA-C基因對可能在自身免疫性疾病的發病中起作用。

對健康人而言，抑制性KIR/HLA受配體對可避免機體發生自身免疫性疾病，因此，抑制性受配體基因對所占比例平衡是維持機體免疫狀態的重要條件，而活化性KIR/HLA受配體對主要增強機體免疫功能以抵抗病原體的入侵，但是它的活化作用往往異常，這又可能成為自身免疫性疾病的易感因素［14］。NK細胞和T細胞是機體重要的具有免疫功能的細胞，表達在NK細胞和部分T細胞表面的KIR受體，通過與特異性 HLA-C類分子結合，向NK/T細胞傳遞活化性或抑制性信號，調節NK/T細胞功能［15］。正常情況下，活化性受體和抑制性受體傳遞的兩種信號總和平衡，使得NK/T細胞功能穩定，可耐受自身正常細胞［16，17］。如果活化性 KIR/HLA-C組合頻率超過了抑制性受配體組合頻率，NK/T細胞接受的活化性信號就多于抑制性信號，對靶細胞的殺傷作用就強，有可能對機體正常組織細胞進行攻擊。相反，如果抑制性信號多于活化性信號，NK/T細胞的殺傷作用就會相對較弱，損傷靶細胞的能力相對減低，不會對機體正常細胞造成損傷［18］。

本研究結果顯示，與健康人群相比，HT患者外周血活化性KIR2DS2/HLA-C1基因對頻率增加，可能通過影響活化性與抑制性KIR/HLA-C受配體對之間的平衡，使NK/T細胞的激活閾值下降，易于被自身抗原激活，破壞機體的免疫穩定狀態，異常激活的NK/T細胞可直接殺傷自身甲狀腺細胞造成甲狀腺組織過度破壞，導致HT相關臨床癥狀的發生。現已證實，CD4+輔助性 T細胞(T helper，Th)的Th1型細胞因子介導的細胞免疫在HT發病中起主導作用［19，20］，異常激活的 NK/T細胞也可分泌 TNF-α、IFN-γ等Th1細胞因子從而間接誘導甲狀腺細胞凋亡，導致自身甲狀腺組織破壞，致使HT的發生。

綜上所述，HT患者外周血中KIR2DS2/HLA-C1基因對頻率增高，使NK/T細胞功能異常導致機體自身免疫功能紊亂，可能是引起HT發病的免疫遺傳學因素之一。對KIR/HLA-C基因對的分析為研究HT的發病機制提供了新的方法，為今后橋本甲狀腺炎的早期診斷早期治療開辟新的思路。但是有關KIR、HLA-C基因在mRNA、蛋白等表達水平的研究仍不完善，有待今后進一步深入的研究。

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