系統性紅斑狼瘡患者血清中Tim-1蛋白水平及其基因多態性①

陳 杰 胡 娜 蘇斌濤 崔天盆(武漢市第一醫院檢驗科，武漢 430022)

人T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)只有3個基因，分別為Tim-1、Tim-3和Tim-4，定位于染色體的5q33.2區域［1］。Tim-1能調節T細胞的增殖，增強 Th2型細胞因子的產生［2］，從而調節Th1/Th2反應;Tim-1還可促進凋亡細胞清除以及調節B調節免疫細胞功能。系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)就是一種自身免疫性疾病，SLE患者Tim-1的mRNA表達水平增高并與疾病的活動程度相關［3］。Kobayashi等［4］在 2007 年報道Tim-1通過磷脂酰絲氨酸結合凋亡的細胞介導凋亡細胞的清除，而 SLE患者存在明顯的凋亡紊亂［5］。Tim-1分子第157氨基酸殘基的位置有六個氨基酸插入的突變157insMTTTVP，即第四外顯子有18個核苷酸的插入。有該突變的個體在感染甲型肝炎病毒后不易患過敏性疾病［6］。SLE與過敏性疾病一樣是一種免疫功能紊亂性疾病。因此，本文將探討Tim-1第4外顯子插入與缺失多態性及其血清水平與SLE發病的關系，推測Tim-1在SLE發病中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 對象 系統性紅斑狼瘡患者92例，女性85人，男性7人。平均年齡41.9歲，范圍從18歲到81歲。全部來自武漢市第一醫院就診患者，都符合美國風濕病學會(ACR)2009年的系統性紅斑狼瘡診斷標準。正常對照來自健康體檢者。女性76人，男性5人，平均年齡42.3歲，范圍從20歲到75歲。沒有自身免疫性疾病病史。

1.2 方法

1.2.1 血清的收集 收集受檢者靜脈血3 ml，離心，取血清，-80℃保存備用

1.2.2 Tim-1蛋白的ELISA檢測 ELISA試劑購自R＆D公司。共檢測健康對照者中26例，SLE患者中47例。鼠抗人的Tim-1蛋白單克隆抗體用0.05 mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3包被緩沖液稀釋至終濃度為 1 μg/ml，空白 96 孔板，每孔加 100 μl，室溫過夜;棄包被抗體，每孔加封閉液(5%BSA-PBS)100 μl，室溫放置 1 h;棄封閉液，用 1%的 Tween20的PBS洗板三次，一次5 min;加入血清和系列稀釋的標準品100 μl，室溫放置1 h;重復上面洗板步驟;加入稀釋至工作濃度的生物素化的兔抗人的Tim-1蛋白的多克隆抗體100 μl，室溫放置1 h;重復上面洗板步驟;加入1∶5 000稀釋的鏈霉親和素-HRP結合物，室溫放置1 h;重復上面洗板步驟;加入顯色試劑TMB顯色20 min，加入 H2SO4終止顯色反應。450 nm測定OD值。繪制工作曲線，計算樣本Tim-1蛋白濃度。

1.2.3 模板DNA的提取 使用血常規采血管收集受檢者靜脈血2 ml，離心，吸取白膜層細胞。用TIANGEN公司的DNA提取試劑盒(貨號:DP304)提取基因組DNA，溶于TE中，-20℃保存備用。

1.2.4 TIM-1的第4外顯子插入與缺失多態性分析 自行設計一對引物，上游引物:5'-TCCAGCCTGAGGCTCCTTGTTT-3'，下游引物:5'-ATGCTCATTGTTGTTGGAACAG-3'。缺失型 PCR產物大小是201 bp，插入型是 219 bp。

PCR反應體系總體積為25 μl，模板 DNA 100 ng，上下游引物各 1 μl(終濃度為 0.4 pmol/μl)，PCR Marster mix(TIANGEN公司貨號:KT201-02)12.5 μl，用雙蒸水補足反應體系的體積。PCR反應條件:94℃ 預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30 個循環。

PCR產物5 μl，用3%的含GoldviewⅠ瓊脂糖凝膠電泳。伯樂凝膠成像分析儀(Bio-Rad chemiDocTMXRS+)進行拍照。缺失/缺失純合子出現一條201 bp的條帶，缺失/插入雜合子出現201 bp和219 bp的兩個條帶，插入/插入純合子只出現219 bp的一個條帶。

1.3 統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本的t檢驗。如果方差不齊，采用兩獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗。基因型和等位基因頻率經哈迪—溫伯格平衡定律檢驗，基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 血清中Tim-1蛋白濃度 47例SLE患者和26例健康對照組血清中Tim-1蛋白濃度分別為(263.083±276.953)和(58.527±92.424)pg/ml。該資料方差不齊，采用秩和檢驗(Z=-4.93，P＜0.05)，兩者之間差異具有統計學意義。Tim-1蛋白濃度在SLE患者中的水平高于健康對照組。

2.2 不同基因型個體血清中Tim-1蛋白濃度比較

SLE患者TIM-1的第4外顯子缺失/缺失純合子29例與缺失/插入雜合子18例的Tim-1蛋白的平均濃度分別為(307.360±284.079)和(191.750±256.708)pg/ml，兩組之間無顯著性差異(t=1.406，P=0.167)。健康對照組TIM-1的第4外顯子缺失/缺失純合子17例與缺失/插入雜合子8例的Tim-1蛋白的平均濃度分別為(70.295±109.917)和(40.468±41.739)pg/ml，兩組之間無顯著性差異(t=0.736，P=0.469)。因為插入/插入基因型的個體數較少，沒有進行統計比較。該突變沒有改變Tim-1蛋白在血清中的濃度。

表1 TIM-1外顯子4ins/del基因型和等位基因頻率Tab.1 The exon 4 of TIM-1 ins/del genotype and allele frequencies

圖1 Tim-1第4外顯子ins/del基因分析圖Fig.1 Ins/del polymorphism of the exon 4 of Tim-1 analysis chart

2.2 基因分型結果圖 缺失/缺失(del/del)純合子出現一條201 bp的條帶，缺失/插入(del/ins)雜合子出現201 bp和219 bp的兩個條帶，插入/插入(ins/ins)純合子只出現219 bp的一個條帶，見圖1。

2.3 TIM-1基因的多態性與系統性紅斑狼瘡的關系的分析 對照組和系統性紅斑狼瘡組中，缺失/缺失純合子出現最多，缺失/插入雜合子次之，插入/插入純合子出現最少。經HWE平衡檢驗，符合哈迪-溫伯格平衡定律，表明該樣本具有抽樣代表性(χ2=0.060，P=0.806)。經卡方檢驗，三種基因型組間差別無統計學意義(χ2=1.723，P=0.437)。Tim-1此基因多態性與SLE無相關性，見表1。

3 討論

人的 Tim基因有三個成員:Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim-3和Tim-1表達于T細胞表面。Tim-3特異性的表達在Th1型細胞上，負性調節Th1細胞反應。Tim-4表達于抗原提呈細胞，是Tim-1的配體。Tim-4與 Tim-1相互作用，調節T細胞的活化增殖［2］。Tim-1是甲型肝炎病毒的受體［7］，T 細胞活化共刺激分子。Tim-1分子第157氨基酸殘基的位置有6個氨基酸插入的突變157insMTTTVP，即第四外顯子有18個核苷酸的插入。有該突變的個體在感染甲型肝炎病毒后不易患過敏性疾病［6］。因此，Tim-1可能參與了免疫系統的調控，該突變可能改變其功能。

SLE是一種多因素的自身免疫性疾病。機體會出現多種自身抗體，補體活化和免疫復合物沉積，導致組織和多器官損傷。輔助性的T細胞主要分化成兩型:Th1和Th2。Th1和Th2細胞功能的失衡在SLE的病理機制中起了重要作用［8］。Tim-1是活化T細胞的共刺激分子，大量表達于CD4+T細胞上，促進Th2型細胞介導的免疫反應［9］，因此參與Th1和Th2細胞功能平衡的調節。SLE會產生許多抗核成分的自身抗體，特別是抗染色質的自身抗體。由于凋亡的發生異常或者凋亡細胞的清除異常，含有染色質的凋亡碎片被釋放。在凋亡的過程中，這些染色質被修飾過，因此增加了自身的免疫原性。樹突狀細胞吞噬這些碎片，活化自身反應性的T輔助性細胞，接著活化自身反應性的B細胞，產生自身抗體。被修飾過的染色質與這些自身抗體結合形成復合物，沉積在基底膜上，引起炎癥。因此，凋亡細胞清除障礙是SLE的一個病因［5］。Tim-1可以結合磷脂酰絲氨酸，促進凋亡細胞的清除［10］。國外Xiao等［11］制作一個Tim-1分子粘蛋白結構域缺失的基因敲除的小鼠，這種突變型的小鼠表現出調節性B細胞分泌IL-10缺陷，這種小鼠隨著年齡的增長會自發系統性自身免疫性疾病，血清中INF-γ和自身抗體的量增加，因此，Tim-1在維持調節性B細胞的負性免疫調節功能中起很重要的作用［11］。

本實驗中，檢測92例SLE患者，81位健康對照個體，沒有發現Tim-1的第4外顯子插入/缺失多態性與SLE的相關性。同時比較不同基因型個體血清中Tim-1蛋白濃度，發現該突變不影響血清中其蛋白濃度。這可能是Tim-1此種基因多態性與SLE無相關性的原因。47個SLE患者和26個健康對照組血清中Tim-1蛋白平均濃度分別為263.083±276.953和58.527±92.424 pg/ml，其差異具有統計學意義。與Wang［3］等報道SLE患者外周淋巴細胞表達Tim-1 mRNA水平增加相對應，我們發現SLE患者血清中Tim-1蛋白濃度是高于健康對照組的。適量的Tim-1蛋白結合磷脂酰絲氨酸，促進凋亡細胞的清除［4］。SLE患者存在凋亡紊亂，SLE外周血淋巴細胞凋亡增加，且凋亡細胞與正常細胞比例與SLE活動度呈正比;凋亡細胞是核小體的重要來源，而核小體與核小體抗體的結合，核小體與硫酸軟骨素的結合是導致狼瘡腎炎的病理生理基礎［5］，腎Tim-1表達水平高，我們推測SLE患者凋亡細胞增加，反饋刺激Tim-1表達增加，導致血清Tim-1蛋白的升高;最近Xiao［11］等研究發現Tim-1是調節性B細胞的表面標記之一，SLE患者血清異常增高的Tim-1可能競爭性干擾調節性B細胞的功能，導致SLE病理進程加速。

總之，Tim-1蛋白在系統性紅斑狼瘡患者血清中的濃度升高，可能干擾凋亡清除或/和調節性B細胞的功能，可能與系統性紅斑狼瘡的病理生理機制有關。有關具體機制有待隨后的研究進一步證實。

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