IL-27 p28基因多態(tài)性與中國漢族人群類風濕性關節(jié)炎的相關性研究①

陳 爽 張慶鎬 方 芳(吉林醫(yī)藥學院免疫學教研室，吉林 132013)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關節(jié)炎為特征的全身性疾病。其多呈漸進型發(fā)展，若不及時治療，易造成不可逆轉(zhuǎn)的關節(jié)畸形和強直，致殘率較高。RA的發(fā)病原因尚不明確，環(huán)境和遺傳因素在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起共同作用。普遍認為類風濕是一種自身免疫性疾病，在病人血清中可出現(xiàn)多種自身抗體，如類風濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗CCP抗體)、抗體周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)等。在發(fā)病的各種因素中，遺傳因素占50%～60%，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的與類風濕關節(jié)炎發(fā)病相關的易感基因包括HLA-DR、PADI4和PTPN22［1-6］等。易感基因的研究有助于闡明RA的發(fā)病機制，并可能成為其預防、治療和預后控制的重要指標。

IL-27是2002年發(fā)現(xiàn)并命名的IL-6/IL-12家族成員，在抗感染抗腫瘤免疫和自身免疫性炎癥等多方面免疫反應中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)它與多種炎性疾病與自身免疫病密切相關，2007年韓國學者分析發(fā)現(xiàn)IL-27p28基因啟動子區(qū)域內(nèi)的964A＞G位點多態(tài)性與韓國人群哮喘易感性有關［7］。2009年有報道白介素27多態(tài)性與韓國人炎癥性腸病有關［8］。在我國，IL-27p28的-964 G等位基因攜帶可能與鼻咽癌病情嚴重程度有關［9］，IL-27基因-964A/G多態(tài)性與大腸癌的發(fā)病具有相關性［10］。IL-27與慢性乙肝病毒感染感染存在一定的相關性，A等位基因可能是HBV易感的遺傳因素［11］。為明確對于中國漢族人群IL-27p28基因多態(tài)性是否有可能與自身免疫性疾病類風濕性關節(jié)炎存在著相關性，本實驗提取了103名RA患者及104名正常人的全血樣本的基因組DNA，所用樣本均來自中國東北地區(qū)沒有血緣關系的人群。采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的基因片段，單堿基延伸進行目的基因分型，利用病例對照方法對所檢測位點進行分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病例組103例，其中男28例，女75例，平均年齡40歲(年齡40～76歲)，病程6個月～15年，所選個體均為漢族人群來自吉林市人民醫(yī)院和延邊大學附屬醫(yī)院，診斷依據(jù)按美國風濕病協(xié)會1987年類風濕性關節(jié)炎診斷標準［12］，臨床資料包括:起病年齡、關節(jié)腫脹和壓痛數(shù)、畸形關節(jié)數(shù)、晨僵時間以及X線檢查和生化檢查指標(紅細胞沉降率ESR，，類風濕因子RF，抗CCP抗體)。健康對照組104例，男43例，女61例，平均年齡57歲(年齡35～71歲)，選自延邊大學附屬醫(yī)院體檢的人群經(jīng)過血清檢測RF為陰性，并且無類風濕性關節(jié)炎的癥狀和體征表現(xiàn)，無自身免疫病家族史，排除感染、腫瘤等疾病。兩組人群性別、年齡均無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 方法 采集外周靜脈血5 ml EDTA抗凝。取2 ml樣本按照外周血基因組DNA提取試劑盒(購自北京天根生化公司RelaxGene Blood DNA System，目錄號DP319-01)說明書提取基因組DNA。DNA樣本分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ锔鶕?jù)Gene Bank上找到的IL-27的基因序列(NC-000016.9)，用軟件primer5.0設計用于擴增的包含啟動子區(qū)g.964A＞G和外顯子區(qū)g.2905T＞G、g.4730T＞C的3對引物(由北京益百尚生物技術(shù)公司合成)。g.964A＞G引物序列為5'-CCTCTACAGAGCAGAAACACCA-3'(上游引物)，5'-GGCTCTGTCTCCATCTTTAACC-3'(下游引物)，擴增片段的產(chǎn)物長度377 bp;g.2905T＞G引物序列為5'-CTGGTTCAAGCTGGTGTCTG-3'(上游引物)，5'-CAGCCTTATCCAGGTTCTATCC-3'(下游引物)，擴增片段的產(chǎn)物長度443 bp;g.4730T＞C引物序列5'-GACCTTTCCTGACCATCTCC-3'(上游引物)，5'-ACTCATACAGACCCACATGCAC-3'(下游引物)，擴增片段的產(chǎn)物長度489bp。PCR擴增反應體系:DNA模板 1 μl，上下游引物各 1 μl，Mix 試劑 10 μl，加滅菌去離子水補足至終體積50 μl。反應條件為94℃預變性 5 min;94℃變性 30 s，60℃退火 1 min，72℃延伸45 s，每個循環(huán)溫度遞減0.5℃，共10個循環(huán);94℃變性 30 s，65℃退火1 min，72℃延伸45 s，共30個循環(huán);72℃延伸3 min，4℃終止反應。PCR反應試劑盒購自北京鼎國呂盛生物技術(shù)公司(通用型PCR試劑盒)。取PCR產(chǎn)物1 μl加緩沖液0.5×TBE，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，GoldView染色觀察結(jié)果，分析PCR擴增情況。

1.3 統(tǒng)計學分析 PCR產(chǎn)物純化后應用BigDye Terminator v3.1試劑盒，在ABI3730自動測序儀上測序(由益百尚生物技術(shù)公司完成)。基因型及等位基因頻率用直接記數(shù)法計算。檢驗Hardy-weinberg平衡吻合度(HWE)統(tǒng)計三個多態(tài)位點在病例組和對照組中預期的基因型頻率，確定所選各組人群是否可以代表中國漢族群體。應用SPSS17.0軟件包采用χ2檢驗進行差異性比較，檢測IL-27p28的-964A/G、2905T/G、g.4730T/C三個位點的基因型頻率與等位基因頻率在病例組及對照組中是否存在顯著性差異，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物擴增 IL-27p28的三個位點分別應用相對應的3對引物進行擴增。在凝膠成像分析儀下成像，所得PCR產(chǎn)物大小與預期的產(chǎn)物一致(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果 對IL-27基因g.964A＞G、g.2905T＞G和g.4730T＞C三個位點的PCR產(chǎn)物進行正向測序。啟動子區(qū)-964位點存在二態(tài)性，在人群中可表現(xiàn)為AA純合型、GG純合型、GA雜合型(圖2)。第二外顯子2905位點也存在二態(tài)性，可表現(xiàn)為TT純合型，GG純合型，TG雜合型，其堿基變化T顛換位G，導致編碼氨基酸由絲氨酸(Ser)變?yōu)楸彼?Alt)(圖3)。第四外顯子區(qū)4730表型僅為TT純合型和TC雜合型，其中T轉(zhuǎn)換為C導致編碼的亮氨酸(Leu)轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?Pro)。

2.3 RA組與對照組IL-27p28的連鎖不平衡性和SNPs與類風濕性關節(jié)炎的相關性分析 對103名類風濕性關節(jié)炎患者和104名正常人進行檢測。三個多態(tài)位點均符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律P＞0.05，證明所收集樣本可以代表群體。組間基因型及等位基因的比較運用SPSS17.0進行統(tǒng)計，結(jié)果三個位點的基因型及等位基因頻率的分布在正常對照組和病例組之間的分布均無顯著性差異(表1)。

圖1 IL-27基因g.2905位點PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of PCR products on g.2905 site of IL-27 gene

圖2 IL-27p28基因-964A＞G位點PCR產(chǎn)物測序圖(GG純合型)Fig.2 Sequencing map of IL-27p28(-964A ＞ G)gene PCR products(AG homozygous)

圖3 IL-27p28基因2905T＞G位點PCR產(chǎn)物測序圖(TG雜合型)Fig.3 Sequencing map of IL-27p28(2905T ＞ G)gene PCR products(TG heterozygous)

圖4 IL-27p28基因g.4730T＞C位點PCR產(chǎn)物測序圖(TC雜合型)Fig.4 Sequencing map of IL-27p28(4730T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

表1 病例組與對照組基因型及等位基因頻率Tab.1 Genotype and allele frequencies in case and control groups

3 討論

白介素 27(Interleukin-27，IL-27)是 2002年Pflanz等發(fā)現(xiàn)并命名的一種新型IL-12家族細胞因子，對不同類型免疫細胞具有重要調(diào)控作用，尤其在調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化與增殖方面具有重要作用［13］。IL-27能協(xié)同IL-12促進初始CD4+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，并促進 Th0 細胞向 Th1 細胞分化［14，15］;同時，IL-27還具有抑制效應Th2細胞功能的作用［16］。而在類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制中CD4+T細胞(Th1/Th0細胞)起重要作用，類風濕性關節(jié)炎患者的Th1成持續(xù)性活化的高反應狀態(tài)。并且已發(fā)現(xiàn)IL-27的增加有利于減輕和緩解關節(jié)炎［17］。因此，IL-27很有可能成為較好的治療類風濕性關節(jié)炎的細胞因子。

對于誘因不明的自身免疫性疾病類風濕性關節(jié)炎現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多易感基因，而IL-27基因多態(tài)性也已發(fā)現(xiàn)出與許多自身免疫病密切相關，所以本研究考慮IL-27基因多態(tài)性會不會與類風濕性關節(jié)炎的易感性相關?本實驗選取2007年韓國學者篩選的IL-27p28基因的4個單核苷酸多態(tài)(single nucleotide poly-morphism，SNP)位點中的 3個位點-964A ＞G、2905T＞G、g.4730T＞C，對其多態(tài)性進行研究，通過病例-對照組研究對IL-27基因單核苷酸多態(tài)位點進行分析。結(jié)果并未檢測到3個多態(tài)位點與中國漢族人群類風濕性關節(jié)炎顯著相關。

分析原因，一方面病例組和對照組的數(shù)量相對較少，另一方面收集的樣本均為漢族人群，而基因多態(tài)性與種族、地域等多方面因素均有關聯(lián)。IL-27的基因多態(tài)性雖然有可能與類風濕關節(jié)炎的易感性無顯著關聯(lián)，但IL-27的血清學變化對類風濕性關節(jié)炎的的調(diào)控和緩解是有顯著的作用的［17，18］，因此IL-27p28很有可能成為治療類風濕性關節(jié)炎的新的靶向因子。

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