IL-18對9L膠質瘤細胞表面分子表達影響的體內外研究

宋楊英 張建軍 陳 穎 單保恩 劉英姿(河北省玉田縣醫院檢驗科，玉田 064100)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤。由于其惡性程度高、侵襲性強、復發率高，常規手術、放化療效果均不佳。免疫治療成為一種治療膠質瘤的新方法。多種免疫刺激劑已經應用到了膠質瘤的免疫治療中［1］，以增強機體抗腫瘤作用，比如IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IFN-γ、IL-12［2，3］。機體通過免疫監視功能識別、殺傷并清除體內突變細胞，防止腫瘤的發生。膠質瘤細胞能夠逃逸機體免疫監視功能與其本身特有的免疫學特征密不可分。①膠質瘤細胞表面MHC類分子表達低，細胞免疫原性弱，導致T細胞抗腫瘤活性下降［4，5］。②膠質瘤細胞表面共刺激分子和黏附分子表達降低［6］，腫瘤抗原呈遞不足。③膠質瘤細胞分泌多種免疫抑制因子［7］，影響腫瘤微環境，使腫瘤局部淋巴細胞浸潤減少，影響T細胞的免疫反應［8，9］。因此若能夠上調膠質瘤細胞表面MHC類分子和(或)CD80、CD86的表達，將對提高機體免疫功能、抑制膠質瘤生長，起到至關重要的作用。

IL-18是一種多效性細胞因子，由于其能夠誘導IFN-γ產生，增強Th1型反應，誘導Th1/Th2細胞分化，增強NK活性，調節機體細胞免疫和體液免疫等多種生物學功能，已被證實有很強的抗腫瘤作用［10，11］。因此，本研究擬通過體內和體外實驗探討外源性IL-18基因轉染對大鼠膠質瘤細胞表面分子表達的影響，為IL-18應用于膠質瘤的臨床治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 9L/IL-18、9L/LXSN及9L細胞由河北醫科大學第四醫院科研中心構建并保存;5～6周齡，雄性Fischer344大鼠(F344大鼠)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號:0191929)。

1.1.2 試劑和儀器

1.1.2.1 主要試劑 DMEM培養基、RPMI1640培養基購自美國Gibco/BRL公司;胎牛血清(FCS)購自杭州四季青公司;PE標記抗大鼠CD80抗體、FITC標記抗大鼠CD86抗體、APC標記抗大鼠MHCⅠ類分子抗體、FITC標記抗大鼠MHCⅡ類分子抗體購自eBioscience公司。

1.1.2.2 主要儀器 流式細胞分析儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術檢測細胞表面MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子及共刺激分子CD80、CD86的表達收集對數生長期9L/IL-18、9L/LXSN、9L細胞各兩瓶，分別用PBS洗細胞1 000 r/min×5 min×2次，0.25%胰酶消化后將細胞分別收集于流式小管中，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次，分別加入PE標記抗大鼠CD80抗體，FITC標記抗大鼠CD86抗體，APC標記抗大鼠MHCⅠ抗體，FITC標記抗大鼠MHCⅡ抗體，常溫避光作用30 min，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次后，流式細胞分析儀檢測。

1.2.2 建立大鼠腦膠質瘤模型

1.2.2.1 細胞準備 ①收集對數生長期9L/IL-18、9L/LXSN及9L細胞，PBS將細胞稀釋為濃度1×108ml－1細胞懸液各1.0 ml，吹打混勻后將細胞懸液移入1.5ml Eppendorf(EP)管，置于冰上待接種。②分別取10 μl 9L/IL-18、9L/LXSN 及9L 細胞懸液，PBS稀釋10倍，加入臺盼藍染液，混勻后各取10 μl于細胞計數板下觀察，死細胞被染成藍色，活細胞圓形透明，不被染色。計數200個細胞，計算活細胞比例。三種細胞內活細胞比例均＞95%。

1.2.2.2 立體定向技術建立大鼠腦膠質瘤模型①將5～6周齡雄性F344大鼠隨機分成3組，每組5只。②接種方法:2%戊巴比妥鈉注射液將F344大鼠腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定向儀上。頭部部分去毛常規消毒后沿頭正中線縱向切開頭皮，暴露出前囪部位。用牙科鉆在前囪中點前1.0 mm，矢狀縫右3.0 mm處鉆一骨孔。10 μl微量進樣器抽取細胞懸液10 μl，固定于三維手動推進儀上，經骨孔垂直進針6.0 mm，再回退1.0 mm后緩慢將細胞懸液推注入大鼠顱內。推注完畢后留針5 min，待細胞充分沉淀后緩慢拔出針頭，縫合頭皮切口(見圖1、2)。手術在無菌條件下進行。手術結束后，由實驗動物中心繼續按SPF飼養動物［1］。接種14 d后分別取大鼠腫瘤組織用于后續實驗。

1.2.2.3 流式細胞分析技術檢測腫瘤細胞表面MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子、共刺激分子CD80、CD86的表達 將新鮮大鼠腫瘤組織制成單細胞懸液，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次，分別加入PE標記抗大鼠CD80抗體，FITC標記抗大鼠CD86抗體，APC標記抗大鼠MHCⅠ類分子抗體，FITC標記抗大鼠MHCⅡ類分子抗體，常溫避光染色30 min，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次后用流式細胞分析儀檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行數據分析。實驗數據以表示。P＜0.05為差異有統計學意義，P＞0.05為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 體外細胞表面分子的表達 9L/IL-18、9L/LXSN及9L細胞表面 CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ類分子的表達均無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 IL-18對腫瘤組織細胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ類分子表達的影響 接種9L/IL-18細胞大鼠腫瘤組織中CD80、CD86、MHCⅠ類分子均高于9L/LXSN和9L組，且差異有統計學意義(P＜0.05);后兩組相比，差異無統計學意義(P＞0.05);MHCⅡ類分子的表達，三組無顯著差別(P＞0.05)。見圖3、表2。

圖1 立體定向技術建立動物模型Fig.1 Establish animal models by stereotactic technique

圖2 接種不同細胞10 d后大鼠狀態Fig.2 Status of rats implanted with different cells for 10 days

表1 不同細胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、CD80和CD86的表達Tab.1 Expression of MHCⅠ，MHCⅡ，CD80 and CD86 on different cells

表2 不同腫瘤組織MHCⅠ、MHCⅡ、CD80和CD86的表達Tab.2 Expression of MHCⅠ，MHCⅡ，CD80 and CD86 on different tumor tissue cells

圖3 流式細胞分析技術檢測接種不同細胞大鼠腫瘤組織CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ的表達Fig.3 Expression of CD80，CD86，MHCⅠ、MHCⅡ in tumor tissues from rats implanted with different cells by FCM

3 討論

本實驗所用9L膠質瘤細胞源于純種近交系Fischer大鼠，與Fischer344大鼠MHC有高度同源性。研究表明，9L/Fischer344大鼠膠質瘤模型在成瘤效果、腫瘤組織形態學特點及腫瘤局部細胞免疫反應等方面與C6/Wistar大鼠膠質瘤模型均存在明顯差別，前者更適合于腫瘤基因免疫治療的研究［12］。

提高腫瘤細胞免疫原性，上調免疫協同刺激因子的表達，可增強機體對腫瘤細胞的識別，從而促進局部免疫反應，抑制腫瘤的免疫逃逸。本實驗中，轉染了IL-18基因后，在體外并不影響9L膠質瘤細胞表面MHC類分子的表達，然而，在體內IL-18可明顯上調膠質瘤組織細胞表面MHCⅠ類分子表達，表明在體內IL-18可增加膠質瘤細胞免疫原性，增強CD8+T對腫瘤的殺傷作用。

研究表明，膠質瘤患者的免疫能力下降，主要是T細胞的抗腫瘤活性下降［9］。膠質瘤細胞可表達FasL，誘導活化的T細胞發生凋亡(活化T細胞表達 Fas)，使腫瘤微環境中浸潤的 T 細胞減少［7，8］。我們的實驗結果表明，9L/IL-18細胞可明顯上調膠質瘤細胞表面MHCⅠ類分子及共刺激分子CD80、CD86表達。MHCⅠ類分子的表達使膠質瘤細胞免疫原性增強，提高免疫系統的免疫監視功能;另外共刺激分子CD80、CD86表達增加，提供了更多T細胞活化的第二信號，可以更多地激活T細胞、促進T細胞增殖、提高T細胞對腫瘤抗原的反應性。

可見，在體內，IL-18可增強9L細胞的免疫原性及抗原遞呈，提高機體抗膠質瘤能力。我們認為IL-18轉染對9L細胞體內外作用不同，是由于在體內IL-18對大鼠整體免疫功能的調節增強了局部抗腫瘤作用。另外，在實驗中我們發現接種了9L/IL-18組大鼠外周血中TGF-β水平顯著下降，CD8+T細胞比例明顯增加，可見IL-18能夠改變膠質瘤大鼠外周血免疫抑制狀態，提高其免疫功能，但是外周血的改變是否影響顱內腫瘤微環境同樣改變還不明確。

［1］Butowski N.Immunostimulants for malignant gliomas［J］.Neurosurg Clin N Am，2010，21(1):53-65.

［2］栗超越，唐 華.膠質瘤的免疫治療［J］.河南醫學研究，2001，10(2):183-186.

［3］林 健，戴學軍，王偉民，等.白細胞介素12基因修飾大鼠膠質瘤9L/rIL-12細胞的建立［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2007，12(7):321-324.

［4］Black KL，Chen K，Becker DP，et al.Inflammatory leukocytes associated with increased immunosuppression by glioblastoma［J］.J Neurosurg，1992，77(1):120-126.

［5］Zhang Y，Wang C，ZhangY，et al.C6 glioma cells retrovirally engineered to express IL-18 and Fas exertFasL-dependent cytotoxicity againstglioma formation［J］，Biochemicaland Biophysical Research Communications， 2004，325(4):1240-1245.

［6］Chong H，Hutchinsoon G，Hart IR，et al.Experesion of B7 costimulatory molecules by B16 melanoma results in a matural killer cell-dependent local anti-tumour response，but induces T-celldependent systemic immunity only against B7-expressing tumors［J］.Br J Cancer，1998，78(8):1043-1050.

［7］Jansen T，Tyler B，Joseph L，et al.FasL gene knock-down therapy enhances the antiglioma immune response［J］.Neuro Oncol，2010，12(5):482-489.

［8］Wei Li，Manuel B.Graeber.The molecular profile of microglia under the influence of glioma ［J］.Neuro Oncol，2012，14(8):958-978.

［9］Van Meir EG.Cytokines and tumors of the central nervous system［J］.Glia，1995，15(2):264-288.

［10］Arend WP，Palmer G，Gabay C.IL-1，IL-18 and IL-33 families of cytokines［J］.Immunol Rev，2008，223:20-38.

［11］Alboni S，Cervia D，Sugama S，et al.Interleukin 18 in the CNS［J］.J Neuroinflammation，2010，7:9

［12］林 健，王偉民，徐如祥，等.9L/Fischer344與 C6/Wistar大鼠腦膠質瘤模型局部細胞免疫反應的比較研究［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2004，9(9):445-448.