結(jié)核分枝桿菌ClpC2蛋白的純化、抗血清的制備及抗原性分析①

穆柳青 李岱容 張春燕 樊 宇 何永林 楊 春

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由MTB引起的一種世界性傳染病，也是當(dāng)今世界由單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾?。?］。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計(jì)，全球大約有1/3人口有潛伏期結(jié)核分枝桿菌的感染，每年約有870萬(wàn)新發(fā)病例，140萬(wàn)人因結(jié)核病死亡［2］。隨著人口數(shù)量的增長(zhǎng)、HIV感染以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的發(fā)病人數(shù)再次上升。有效地控制結(jié)核病的發(fā)展和傳播已刻不容緩。因此尋找穩(wěn)定、高效的檢測(cè)方法和研發(fā)有效的疫苗成為當(dāng)今防治結(jié)核病的工作重點(diǎn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，大部分原核生物擁有ATP依賴的絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)，例如Lon和Clp蛋白酶［3］，Clp蛋白酶參與調(diào)節(jié)生物體蛋白質(zhì)代謝，清除不可逆損傷蛋白質(zhì)、對(duì)外應(yīng)激耐受及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在細(xì)菌的生長(zhǎng)與致病過程中起重要作用。ClpC2是結(jié)核分枝桿菌Clp蛋白酶的調(diào)節(jié)亞基，也是潛在的抗結(jié)核藥物的靶標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)通過表達(dá)純化ClpC2蛋白，并制備相應(yīng)多克隆抗體，為后續(xù)深入研究兔抗ClpC2多克隆抗體的生物功能、驗(yàn)證ClpC2作為診斷靶標(biāo)、藥靶候選蛋白的可行性提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌BL21(DE3);BCG和質(zhì)粒表達(dá)載體pET32a(+)均為重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)感染性疾病實(shí)驗(yàn)室保存;重組質(zhì)粒pET32a(+)-ClpC2為重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)感染性疾病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 氨芐青霉素(Ampicillin Na)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，上海);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma公司，美國(guó));蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas公司，德國(guó));Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京);HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG、DAB顯色試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京);MTB H37Rv感染的小鼠血清為重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)感染性疾病實(shí)驗(yàn)室保存;健康雄性新西蘭大白兔購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;正常人血清、結(jié)核病人血清來(lái)自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科。

1.2 方法

1.2.1 rClpC2的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET32a(+)-ClpC2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽(yáng)性克隆菌接種于3 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩13 h;取3 ml菌液接種于500 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩培養(yǎng)3 h;加入IPTG使其終濃度為1 mmol/ml，37℃ 振蕩誘導(dǎo) 3 h，進(jìn)行 12%SDSPAGE分析;將誘導(dǎo)重組表達(dá)菌離心收集菌體，以5 g/ml濕菌的比例加入超聲緩沖液，冰浴中超聲碎菌(功率3 00 W，超聲3 s，間隔 3 s，共30 min);4℃離心，分別收集上清和沉淀(包涵體)，SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)形式。

1.2.2 rClpC2的 Western blot鑒定 rClpC2經(jīng)12%SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，分別加入MTB H37Rv株感染的小鼠血清(1∶50)稀釋;4℃孵育過夜;PBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋);室溫作用1 h，DAB顯色觀察結(jié)果。

1.2.3 rClpC2的純化 將細(xì)菌裂解液上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后負(fù)載上Ni-Agarose His柱，按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，對(duì)收集液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定;按照BCA蛋白定量試劑盒對(duì)收集的蛋白溶液進(jìn)行濃度測(cè)定;通過Bandscan分析rClpC2的表達(dá)量及純度。

1.2.4 兔抗血清的制備 新西蘭大白兔免疫前取耳緣靜脈血2 ml，分離血清置于－80℃保存?zhèn)溆谩⒓兓膔ClpC2與等體積弗氏完全佐劑經(jīng)研磨充分乳化;分別在白兔脊背，左右腳足墊，左右腹股溝皮下注射乳化液，注射量2 ml/只，每只抗原免疫用量1.0 mg。3周后進(jìn)行首次加強(qiáng)免疫，2周后用同樣的方法加強(qiáng)免疫，以后每隔1周加強(qiáng)免疫1次，共免疫5次，其中第二、三次加弗式不完全佐劑，第四次免疫后于兔耳緣靜脈采血，通過瓊脂糖雙擴(kuò)法檢測(cè)特異性抗體的效價(jià);第五次加強(qiáng)免疫7 d后，對(duì)白兔進(jìn)行心臟取血40 ml，全血置37℃1 h，4℃過夜，收集血清，分裝置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 兔抗血清特異性的鑒定 BCG經(jīng)超聲碎菌后的混合液經(jīng)12%SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加入兔抗rClpC2血清(1∶100稀釋)，4℃孵育過夜;PBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫作用1 h，DAB顯色觀察結(jié)果。

1.2.6 兔抗血清效價(jià)的測(cè)定 通過雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定血清效價(jià)。以生理鹽水配置含1%瓊脂糖、1%PEG6000的溶膠，加熱融化澆注于潔凈的載玻片上，每張載玻片約3～5 ml;待瓊脂凝固后打孔形成梅花形。將待測(cè)抗體于1∶2～1∶128稀釋，順時(shí)針方向加入周圍孔中，抗原原液1∶2稀釋后加入中間孔，每孔約10 μl。放置于濕盒37℃作用24 h后觀察結(jié)果。

1.2.7 間接ELISA法檢測(cè)兔抗血清效價(jià) 用碳酸鹽緩沖液將重組蛋白ClpC2溶解并調(diào)整濃度為10 μg/ml;在96孔酶聯(lián)板中加入上述包被液，每孔100 μl;將酶聯(lián)板置于濕盒中，4℃過夜;次日，棄包被液，PBS洗滌3次;加封閉液，每孔 300 μl，37℃放置 2 h;棄去封閉液，PBST洗滌3次;加入倍比稀釋的第五次免疫1周后采集的兔血清，每孔100 μl，37℃放置2 h;棄去稀釋的兔抗血清，PBST洗滌4次，每次間隔3 min;加入1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，每孔100 μl，37℃ 孵育 1 h;棄去抗體，PBST 洗滌 4次，每次間隔3 min;加入顯色液 TMB，每孔100 μl，37℃孵育15 min;每孔加入50 μl終止液顯色，在450 nm波長(zhǎng)出測(cè)吸光度值OD450。抗體滴度定義為:OD樣品與OD陰性之比大于或等于2.1時(shí)最大的血清稀釋倍數(shù)。

1.2.8 間接ELISA法檢測(cè)ClpC2蛋白的抗原性rClpC2包被96孔酶聯(lián)板，濃度為10 μg/ml;每孔100 μl。用間接ELISA法對(duì)結(jié)核陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行測(cè)定，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值OD450。陰性對(duì)照血清標(biāo)本的平均OD值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)方差(Standard deviation，SD)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，若病人血清標(biāo)本OD值大于此標(biāo)準(zhǔn)，即判斷為陽(yáng)性，反之則為陰性。據(jù)此評(píng)價(jià)抗原的反應(yīng)活性。

1.2.9 間接ELISA檢測(cè)TB血清中ClpC2抗原將健康人血清、肺結(jié)核病人血清1∶100稀釋，包被96孔酶聯(lián)板，每孔100 μl;兔抗血清 1∶100稀釋作為一抗。間接ELISA法對(duì)結(jié)核陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行測(cè)定，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值OD450。陰性對(duì)照血清標(biāo)本的平均OD值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)方差(Standard deviation，SD)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，若病人血清標(biāo)本OD值大于此標(biāo)準(zhǔn)，即判斷為陽(yáng)性，反之則為陰性。據(jù)此評(píng)價(jià)兔抗血清檢測(cè)肺結(jié)核病人的敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 rClpC2表達(dá)形式的分析 SDS-PAGE分析顯示，含有pET32a(+)空質(zhì)粒的表達(dá)菌BL21(DE3)經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)蛋白相對(duì)分子量大小為20 kD的Trx(硫氧還原蛋白)，含有 pET32a(+)-ClpC2的表達(dá)菌BL21(DE3)經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白相對(duì)分子量約為46 kD，與Trx-ClpC2(相對(duì)分子量26.7 kD)融合蛋白的相對(duì)分子量大小相符;rClpC2以可溶性和不可溶性兩種形式存在，但主要以可溶性的形式存在于上清液中;見圖1。

圖1 rClpC2表達(dá)形式的分析Fig.1 Analysis of rClpC2 expression form

2.2 rClpC2的 Western blot鑒定 Western blot 分析顯示，rClpC2可與MTB H37Rv感染的小鼠血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量46 kD處可見明顯條帶，見圖2。

2.3 純化蛋白的鑒定及濃度測(cè)定 細(xì)菌裂解液上清經(jīng)Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量46 kD處可見一特異條帶，與目的蛋白ClpC2大小相符，見圖1;經(jīng)Bandscan分析rClpC2約占菌體總蛋白的 58.7%，純化后 rClpC2的純度為88.5%;通過 BCA法測(cè)得純化蛋白濃度為1.0 mg/ml。

2.4 兔抗血清的Western blot鑒定 Western blot分析顯示，兔抗血清可與BCG中ClpC2蛋白反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量26 kD處可見明顯條帶，見圖3。

2.5 兔抗血清效價(jià)的測(cè)定 免疫擴(kuò)散24 h后，分別在稀釋2、4、8、16、32倍的血清與抗原之間出現(xiàn)了明顯的沉淀線，制備的兔抗血清效價(jià)為1∶32，見圖4。

2.6 間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià) 經(jīng)五次免疫后，從兔心臟取血，以免疫前兔血清為陰性對(duì)照，ELISA測(cè)得兔抗血清的效價(jià)為1∶320 000以上，見圖5。

2.7 rClpC2蛋白的抗原性分析 以正常人血清的OD值+2S為正常界限值，ClpC2抗原在檢測(cè)肺結(jié)核病人中的檢出率為46%，檢測(cè)敏感性為46%，特異性為90%，見圖6。

2.8 間接ELISA檢測(cè)TB血清中ClpC2抗原 以正常人血清的OD值+2S為正常界限值，兔抗血清在檢測(cè)肺結(jié)核病人中的檢出率為40%，檢測(cè)敏感性為40%，特異性為90%，見圖7。

圖2 rClpC2的Western blot鑒定Fig.2 Western blot results of rClpC2

圖3 兔抗血清的Western blot鑒定Fig.3 Western blot results of rabbit antiserum

圖4 兔抗血清效價(jià)測(cè)定Fig.4 Determination of rabbit antiserum titer

圖5 兔抗血清效價(jià)的ELISA測(cè)定Fig.5 Detection of rabbit antiserum titer by ELISA

圖6 臨床血清ClpC2抗體的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Indirect ELISA test results of clinical serum ClpC2 antibody

圖7 臨床血清ClpC2抗原的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Indirect ELISA test results of clinical serum ClpC2 antigen

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大部分原核生物擁有一種ATP依賴的酪氨酸蛋白酶復(fù)合物，而多數(shù)放線菌和古細(xì)菌體內(nèi)含有的是蘇氨酸蛋白酶，有趣的是結(jié)核分枝桿菌擁有蘇氨酸蛋白酶和酪氨酸蛋白酶(Clp蛋白酶)這兩種蛋白酶，然而近年來(lái)對(duì)于結(jié)核分枝桿菌蛋白酶的研究主要集中于蘇氨酸蛋白酶方面［4］，而對(duì)于結(jié)核分枝桿菌Clp蛋白酶的研究相對(duì)較少。

原核生物的ATP依賴的蛋白酶Clp系統(tǒng)是由多個(gè)Clp蛋白組成的復(fù)合體，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，大多數(shù)Clp蛋白可分為兩大類:ClpP蛋白家族和Hsp/Clp分子伴侶家族。Clp蛋白家族成員組成Clp蛋白酶的催化亞基(ClpP)，Hsp/Clp分子伴侶家族成員組成Clp蛋白酶的調(diào)節(jié)亞基(或稱為ATP酶亞基)，如 ClpA、ClpB、ClpC、ClpE 等。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Clp蛋白酶是病原菌致病力的基本元件。Clp蛋白通過調(diào)控毒力因子的表達(dá)影響細(xì)菌的毒力，在肺炎鏈球菌感染的小鼠模型中ClpP缺陷株的毒力低于野生型。ClpL不僅能調(diào)節(jié)幾種毒力因子的表達(dá)，還影響肺炎鏈球菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲能力［5］;而在金黃色葡萄球菌中ClpC調(diào)節(jié)其主要毒力因子的轉(zhuǎn)錄［6］。Clp蛋白酶還參與菌體耐高溫、耐氧等應(yīng)激反應(yīng)，ClpB與單核細(xì)胞增多性李斯特菌和金黃色葡萄球菌能夠在高熱的情況下生長(zhǎng)并且具有耐熱性有關(guān)［7］?？莶菅挎邨U菌ClpX的缺陷株對(duì)熱具有高度的敏感性［8］。在缺氧環(huán)境下，結(jié)核分枝桿菌Clp蛋白酶基因調(diào)節(jié)子ClgR(轉(zhuǎn)錄因子)的功能受到抑制，在細(xì)菌復(fù)制過程中控制其轉(zhuǎn)錄、翻譯和氧化磷酸化的基因也會(huì)受到抑制。若是恢復(fù)結(jié)核分枝桿菌的有氧條件，這些控制細(xì)菌轉(zhuǎn)錄的基因功能將會(huì)上調(diào)達(dá)到高潮。由此可以推斷ClgR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子與結(jié)核分枝桿菌在缺氧條件下恢復(fù)轉(zhuǎn)錄功能有關(guān)［9］。

由此可以看出Clp蛋白酶可通過蛋白水解作用清除這些非正常和具有潛在毒性的蛋白或多肽，從而幫助病原菌適應(yīng)宿主環(huán)境;這種蛋白酶系統(tǒng)還可通過蛋白水解作用控制細(xì)菌體內(nèi)代謝過程中關(guān)鍵酶的穩(wěn)定性，保證菌體代謝的正常進(jìn)行并在病原菌致病過程中發(fā)揮著重要功能。

然而，MTB較其他病原菌的ATP依賴的Clp蛋白酶系統(tǒng)更為復(fù)雜和獨(dú)特，它的Clp蛋白酶系統(tǒng)由雙拷貝的ClpP(包括ClpP1和ClpP2)和四個(gè)ATPase(ClpX、ClpC1、ClpC2、ClpB)組成，且 ClpP1 和 ClpP2與MTB的生長(zhǎng)密切相關(guān)，敲除任何一個(gè)基因，都會(huì)導(dǎo)致MTB死亡，同時(shí)它們?cè)诰w清除不正常蛋白的活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用［10］;研究發(fā)現(xiàn)，MTB 的ClpP1與ClpP2基因的共同缺陷菌株在巨噬細(xì)胞中的活力和毒力均會(huì)下降［11］;在MTB和許多的革蘭陽(yáng)性菌中ClpC通常與ClpA直接同源，ClpC1的功能抑制，對(duì)培養(yǎng)和巨噬細(xì)胞中潛伏的MTB都具有致死性［12］?？股谻yclomarin A通過與酪氨酸蛋白酶調(diào)節(jié)亞基ClpC1結(jié)合，進(jìn)而影響ClpC1P的蛋白水解作用，從而殺死結(jié)核分枝桿菌，所以ClpC1有可能成為結(jié)核分枝桿菌理想的藥靶候選蛋白［13］。目前，關(guān)于抗MTB ClpC2多克隆抗體的生物學(xué)特性及ClpC2蛋白酶在MTB生長(zhǎng)能力、應(yīng)激能力中的作用以及ClpC2P1或ClpC2P2的其他生物學(xué)功能等的相關(guān)研究，文獻(xiàn)所提供的信息較少。

另外，MTB抗原多而復(fù)雜，在宿主體內(nèi)表達(dá)的數(shù)量、種類或時(shí)機(jī)有可能隨病人的個(gè)體免疫背景和病程而異，表現(xiàn)出不同的抗體譜，檢測(cè)時(shí)有的抗原不表達(dá)，未檢測(cè)出相應(yīng)的抗體，有的抗體含量高，有的則低。Konstantin等［14］報(bào)道10種重組MTB蛋白抗原，分別檢測(cè)同一病人其反應(yīng)有所不同。這就更增加了確認(rèn)能適合大多數(shù)人群的診斷試劑所需抗原的困難性。因此多種抗原聯(lián)合檢測(cè)，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高靈敏度。

本研究通過純化蛋白得到純度較高的rClpC2，成功制備兔抗ClpC2多克隆抗體，制備的多克隆抗體可與 BCG中的 ClpC2發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，因ClpC2具有很高的保守性從而證實(shí)制備的多克隆抗體具有良好的特異性;首次采用純化的rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗體進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在肺結(jié)核病人的血清學(xué)檢測(cè)中具有一定的敏感性和特異性，說明純化的rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗體可作為結(jié)核病血清學(xué)診斷的混合抗原或抗體之一。在今后的研究中，考慮多抗原或多抗體混合使用，嘗試不同抗原或抗體組合策略，以提高結(jié)核檢測(cè)的靈敏度和特異性。

［1］董江濤，徐 芳，張萬(wàn)江，等.不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染小鼠對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡率及其時(shí)相性變化的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28(5):389-392.

［2］WHO.Global Tuberculosis Control.In WHO Global Tuberculosis R eport 2012;http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/index.html.

［3］Frees D，Savijoki K，Varmanen P，et al.Clp ATPases and ClpP proteolytic complexes regulate vital biological processes in low GC，Gram-positive bacteria［J］.MolMicrobiol，2007，63(5):1285-1295.

［4］Burns KE，Pearce MJ，Darwin KH.Prokaryotic ubiquitin-like prot ein provides a two-part degron to Mycobacterium proteasome substrates［J］.J Bacteriol，2010，192(11):2933-2935.

［5］Tu le N，Jeong HY，Kwon HY，et al.Modulation of adherence，inv asion，and tumor necrosis factor alpha secretion during the early stages of infection by Streptococcus pneumoniae ClpL［J］.Infect Immun，2007，75(6):2996-3005.

［6］Luong TT，Sau K，Roux C，et al.Staphylococcus aureus ClpC div ergently regulates capsule via sae and codY in strain newman but activates capsule via codY in strain UAMS-1 and in strain Newman with repaired saeS［J］.J Bacteriol，2011，193(3):686-694.

［7］Chastanet A，Derre I，Nair S，et al.clpB，a novel member of the Listeria monocytogenes CtsR regulon，is involved in virulence but not in general stress tolerance［J］.Bacteriol，2004，186(4):1165-1174.

［8］Gerth U，Krüger E，Derré I，et al.Stress induction of the Bacillus subtilis clpP gene encoding a homologue of the proteolytic component of the Clp protease and the involvement of ClpP and ClpX in stress tolerance［J］.Mol Microbiol，1998，28(4):787-802.

［9］Sherrid AM，Rustad TR，Cangelosi GA，et al.Characterization of a Clp protease gene regulator and the reaeration response in Mycobacterium tuberculosis［J］.PLoS One，2010，5(7):e11622.

［10］Raju RM，Unnikrishnan M，Rubin DH，et al.Mycobacterium tubercu losis ClpP1 and ClpP2 function together in protein degradation and are required for viability in vitro and during infection［J］.PLoS Pathog，2012，8(2):e1002511.

［11］Carroll P，F(xiàn)aray-Kele MC，Parish T.Identifying vulnerable pathw ays in Mycobacterium tuberculosisby using a knockdown approach［J］.ApplEnviron Microbiol，2011，77(14):5040-5043.

［12］Schmitt EK，Riwanto M，Sambandamurthy V，et al.The natural product cyclomarin kills Mycobacterium tuberculosis by targeting the ClpC1 subunit of the caseinolytic protease［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2011，50(26):5889-5891.

［13］Vasudevan D，Rao SP，Noble CG.Structural Basis of Mycobact erial Inhibition by Cyclomarin A［J］.J Biol Chem.2013.

［14］Konstantin L，Roberto L，Michel H，et al.Heterogencous antibody responses in tuberculosis［J］.Infect Immun，1998，66(8):3936-3940.