BALB/c小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株移植模型的建立①

嚴(yán) 麗 李 莉 郝 芳 申 偉 張霖雷 郭 浩

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腺體外科，石家莊 050000)

乳腺癌的發(fā)病率已位居女性惡性腫瘤的首位，且呈年輕化的趨勢(shì)，有關(guān)乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療方面的實(shí)驗(yàn)研究越來越多，而在實(shí)驗(yàn)中最為重要的就是乳腺癌動(dòng)物模型的制備。目前報(bào)道多為人乳腺癌細(xì)胞的裸鼠異種移植模型，而小鼠乳腺癌細(xì)胞移植模型的報(bào)道較少。4T1細(xì)胞是建立BALB/c小鼠乳腺癌模型較常用的一種細(xì)胞株，但在模型制備中所采用的細(xì)胞用量往往不統(tǒng)一，用量小造成制模時(shí)間延長(zhǎng)或制模失敗;用量大造成細(xì)胞浪費(fèi)，增加實(shí)驗(yàn)成本。本實(shí)驗(yàn)采用三種常用劑量、兩種不同接種部位進(jìn)行比較，希望選擇一種理想的模型制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料 健康BALB/c小鼠90只(購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，雌性，4～6周齡，體重18～20 g，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)分為3組，每組各30只;4T1乳腺癌細(xì)胞株(購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù));胎牛血清;RPMI1640完全培養(yǎng)基;抗小鼠C-erbB-2抗體等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和模型制備 將4T1細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，分別制備成 1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1的細(xì)胞懸液。分別在3組 BALB/c小鼠胸壁5～6肋間和側(cè)腹壁皮下接種相應(yīng)濃度的細(xì)胞懸液0.1 ml(3組劑量相當(dāng)于105/只、106/只和107/只)。

1.2.2 模型評(píng)定方法 注射4T1細(xì)胞后，每天觀察小鼠生活飲食及接種部位瘤塊的生長(zhǎng)情況，包括瘤體出現(xiàn)時(shí)間、瘤體大小、成瘤率和8周存活率。第1～8周每隔2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，并根據(jù)V=ab2/2計(jì)算瘤體體積，繪制生長(zhǎng)曲線。留取瘤體組織進(jìn)行HE染色，病理觀察。用抗小鼠C-erbB-2單克隆抗體對(duì)瘤體組織進(jìn)行免疫組化染色，鏡下觀察。

圖1 小鼠乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(HE，×400)Fig.1 Mice breast invasive ductal carcinoma(HE，×400)

圖2 乳腺癌組織C-erbB-2陽(yáng)性表達(dá)(×400)Fig.2 Expression of C-erbB-2 in breast tumor tissues( ×400)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長(zhǎng)情況和病理學(xué)檢查結(jié)果 接種4T1細(xì)胞8～17 d時(shí)，接種部位出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，瘤體增大并與周圍組織黏連。14 d后瘤體生長(zhǎng)加快，30 d后部分小鼠成瘤部位皮毛破潰。8周后統(tǒng)一處死小鼠，解剖可見瘤體淡黃粉色，具有完整包膜并與周圍組織黏連，部分伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。瘤體質(zhì)地中等偏硬，多呈圓形或橢圓形分葉狀，組織細(xì)胞呈索團(tuán)狀排列，局部可見壞死灶;鏡檢見癌細(xì)胞體積大，胞質(zhì)嗜酸性，核大，核仁清晰，病理診斷為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(見圖1)。瘤體組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)C-erbB-2均呈陽(yáng)性表達(dá)(見圖2)。

表1 不同組別成瘤狀況比較(n=30)Tab.1 Different groups of tumor status(n=30)

表2 不同接種部位成瘤狀況比較(n=45)Tab.2 Different parts of tumor status(n=45)

圖3 不同接種濃度下瘤體生長(zhǎng)曲線(瘤體體積數(shù)值為平方根值)Fig.3 Growth curve of tumor inoculation concentration(Tumor volume number is expressed as square root of itself)

2.2 成瘤時(shí)間、成瘤率及荷瘤小鼠存活時(shí)間 見表1。

2.3 不同接種部位成瘤時(shí)間、成瘤率及存活時(shí)間見表2。

2.4 移植瘤的生長(zhǎng)曲線 見圖3。

3 討論

隨著乳腺癌發(fā)病率的逐年升高及年輕化趨勢(shì)的加強(qiáng)，人們對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療的研究越來越深入，也越來越成為熱點(diǎn)。而乳腺癌動(dòng)物模型的制備，在這一過程中起著非常關(guān)鍵的作用。根據(jù)制備方法和研究目的的不同，乳腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可分為移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性、基因敲除性及乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等5大類。移植性模型是將乳腺癌細(xì)胞或組織種植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胸部或腹部而培養(yǎng)出的模型。此種模型因其生長(zhǎng)速度快、成瘤率高、易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床應(yīng)用最廣的一種模型。誘發(fā)性模型是利用物理、化學(xué)或生物等因素在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)腫瘤。該模型多用于病因?qū)W及預(yù)防性研究，缺點(diǎn)是個(gè)體差異大和建模時(shí)間長(zhǎng)。自發(fā)性模型是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群中自然發(fā)生或通過遺傳育種培養(yǎng)而形成的一類腫瘤。從腫瘤發(fā)生來看與人類腫瘤相似，有利于發(fā)病機(jī)制的研究;但是，該模型實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，花費(fèi)大。基因敲除性模型多用于腫瘤發(fā)生發(fā)展中基因生物學(xué)功能的研究。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型多用于藥物開發(fā)［1-4］。

目前，乳腺癌動(dòng)物模型中所選用的動(dòng)物多為小鼠、裸鼠、大鼠、貓等，其中小鼠和裸鼠因誘癌周期短多被選用。但裸鼠飼養(yǎng)成本較高且免疫功能缺陷不適于臨床治療方面的研究。本實(shí)驗(yàn)是針對(duì)免疫功能正常的小鼠乳腺癌移植模型的制備，采用的近交系BALB/c小鼠，來源于BALB/c小鼠的乳腺癌細(xì)胞株文獻(xiàn)報(bào)道比較多的是4T1和TM40D兩種細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)選取4T1細(xì)胞株移植于BALB/c小鼠建立乳腺癌模型，這種模型是目前臨床藥物篩選使用最多的一種乳腺癌模型［5-8］。目前，很多文獻(xiàn)報(bào)道的4T1細(xì)胞用量存在很大的差異，本實(shí)驗(yàn)選取了1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1三種常用劑量，同時(shí)又分別選取了胸壁5～6肋間和側(cè)腹壁兩個(gè)常用注射部位進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種不同注射部位種植成活率和腫瘤生長(zhǎng)情況之間無差別(P＞0.05)。1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1三種常用劑量的種植成活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，1×106ml－1時(shí)腫瘤的成瘤時(shí)間延遲，種植后16 d左右于接種部位觸及直徑約2 mm結(jié)節(jié)，以后迅速增大，于第24天左右直徑約10 mm;第30天腫瘤長(zhǎng)徑約20 mm;其后增長(zhǎng)緩慢。1×107ml－1時(shí)腫瘤成瘤時(shí)間相對(duì)早，于種植后10 d左右于接種部位觸及直徑約2 mm結(jié)節(jié)，18 d左右直徑約10 mm，26 d腫瘤長(zhǎng)徑約18 mm，其后增長(zhǎng)緩慢。1×108ml－1時(shí)腫瘤成瘤時(shí)間與1×108ml－1時(shí)相似，但是腫瘤生長(zhǎng)更為迅速。對(duì)于臨床用藥觀察來說，1×107ml－1的用量更為經(jīng)濟(jì)合理，更易于用藥周期的安排，是最理想的模型制作方法。

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