新疆地區維、漢民族缺血性卒中與ADP基因多態性的相關性研究①

張震中 梁曉鷹 呂光耀 姚 華(新疆醫科大學，烏魯木齊 830054)

腦卒中目前是導致人類死亡的三大疾病之一，腦卒中是遺傳因素和環境因素共同作用的多基因病，確定腦卒中的易感基因乃至找到關鍵基因，可以從分子水平對腦卒中的發病機制有進一步認識，由于腦卒中是多基因病，在檢測多基因病的多個基因微效效應方面，候選基因關聯分析主要是選擇與多基因疾病有生物學聯系的基因或者與該疾病已知相關基因具有同源性的基因作為候選基因，研究該候選基因與該疾病的發病是否具有相關性。薈萃分析結果提示脂聯素基因單核苷酸多態性與腦卒中之間存在著顯著的關聯［1］。一項Meta分析提示脂聯素水平降低與腦卒中的發生密切相關［2］。胡曉波等［3］研究發現脂聯素基因-3971A/G多態性的 GG型可能是缺血性卒中發病的一個獨立危險因子。脂聯素(Adiponectin，APN)是新近發現的脂肪組織特異性分泌的激素蛋白，研究表明APN在多種疾病的發生、發展過程中發揮抵抗作用，是一種保護性脂肪因子［4，5］。APN 具有血管內皮保護作用，增加內皮源性NO的產生與釋放［6］。APN增加脂肪酸的氧化，降低血TG水平，減少脂質沉積，促進巨噬細胞的裂解，從而抑制血管平滑肌細胞和外周血單核細胞的增殖及巨噬細胞向泡沫細胞的轉變，抑制動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的形成［7］。臨床研究表明，缺血性卒中患者血清APN水平較健康對照組顯著降低［8］。

新疆屬我國的腦卒中高發地區，存在明確的民族及環境特征，由于動脈粥樣硬化是心腦血管最為常見的共同病因基礎，本研究定位于脂質代謝相關的脂肪細胞因子Adiponectin，對新疆維漢民族缺血性腦卒中患者進行脂聯素基因多態性及其相關的研究，通過分子生物學原理研究其與腦卒中的相關性及其在維漢民族之間有無差異。

1 材料與方法

1.1 研究對象和分組

1.1.1 病例組 所有入選的研究對象均來源于2011年3月至2013年3月在新疆醫科大學附屬中醫醫院神經內科及喀什地區第一人民醫院神經內科的住院病人210例，其中漢族121例，平均年齡(58.71±9.32)歲，男67例，女54例;維吾爾族89例，平均年齡(57.44±10.15)歲，男53例，女36例。全部均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》［9］的急性腦卒中的診斷。

1.1.2 對照組 同期在新疆醫科大學附屬中醫醫院體檢人群104例，其中漢族47例，平均年齡(55.21±10.92)歲，男26例，女21例;維吾爾族57例，平均年齡(56.24±11.37)歲，男34例，女23例;所有患者均排除腦血管病、自身免疫性疾病、肝腎功能不全和惡性疾病。

1.2 研究方法 對符合納入標準的維族、漢族缺血性腦卒中患者和對照組人群抽取血樣，進行DNA提取，統一進行基因檢測工作。實驗步驟:(1)通過haploview軟件，設定 Taggle_SNPs，篩選 MAF＞0.5以上的SNPs位點信息并與之前查找的基因進行比對，確定本次研究所需SNPs位點信息。(2)基因DNA提取:所有研究對象均取外周血采用苯酚氯仿抽提法。見圖1。(3) SNaPshot技術檢測Adiponectin基因SNPs。(4)引物設計及合成:根據SNP位點序列信息，使用Premier 5.0軟件設計、擴增、延伸并合成引物。(5)PCR反應體系:10 μl PCR 反應體系:2.5×Buffer 4.0 μl，上游引物(10 μmol/L)0.2 μl，下游引物(10 μmol/L)0.2 μl，Tag(5 U/μl)0.1 μl，DNA(50～ 100 ng/μl)1.0 μl，ddH2O 4.7 μl。擴增程序:95℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s×32 cycles;72℃ 8 min。預擴增產物質檢:取2 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。(6)3730XL測序儀檢測:①96孔板中每孔加入分子量內標和甲酰胺混合液(0.5、8.5)9 μl，PCR 產物0.8 μl;②95℃變性3 min，上機檢測;(7)PCR直接測序:直接測序是確定突變位點堿基的金標準，由北京閱微基因生物公司完成測序和測序峰圖。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件，計數資料的比較采用χ2檢驗，基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗。Hardy-weinberg平衡檢驗采用擬合優度χ2檢驗。

2 結果

2.1 Adiponectin基因3個位點Hardy-weinberg平衡檢驗結果 分別對病例組和對照組ADP基因SNP位點分型采用了擬合優度卡方檢驗，計算其Ho、He，結果顯示病例組和對照組基因SNP位點基因型頻率分布沒有偏離Hardy-weinberg平衡(P＞0.05)(表1)，因此我們選取的樣本人群具有代表性適合做遺傳學分析。

2.2 Adiponectin基因3個位點SNaPshot方法判定基因類型 使用SNaPshot方法進行SNP位點測序，峰值圖見圖2～4。

圖1 電泳結果Fig.1 Electrophoresis results

表1 Adiponectin基因Hardy-weinberg平衡檢驗結果Tab.1 Results of Adiponectin gene Hardy-weinberg equilibrium test

2.3 病例組與對照組Adiponectin基因頻率比較將兩組研究對象分為病例組和對照組后，根據不同基因SNPs位點進行比較，從表2中可以看出，rs6444175G/A位點基因頻率分布有統計學差異(χ2=13.882，P=0.001)。由于病例組rs6444175G/A基因型GA頻率(44.3%)高于對照組(23.1%)，因此對rs6444175G/A位點GA基因型進一步進行統計學處理，如表3所示，應用條件Logistic回歸校正傳統危險因素，如高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血、吸煙，GA基因型頻率病例組明顯高于對照組，差異有統計學意義(OR=1.269;95%CI:1.001～1.952;P=0.012)，提示rs6444175GA基因型是缺血性腦卒中的獨立危險因素，患缺血性腦卒中的風險率增加至1.269倍。

2.4 維、漢族人群病例組和對照組 Adiponectin基因型頻率比較 維、漢族人群與其對照組進行比較，Adiponectin 3個SNP位點基因型類型分布，通過χ2檢驗，未見顯著差異。但從表4中可以看出，維吾爾族rs182052基因型CC+CT病例組中占到85.2%，對照組中占到84.2%;rs6444175基因型GG+GA病例組中占到89.9%，對照組中占到92.9%;rs1501296基因型GA+AA病例組中占到89.9%，對照組中占到87.7%;與整組研究對象相比，維族人群中病例組與對照組各個SNP位點基因型分布呈一致性。

圖2 Adiponectin SNPrs182052測序峰值圖Fig.2 Adiponectin SNPrs182052 sequencing peak figure

圖3 Adiponectin SNP rs6444175測序峰值圖Fig.3 Adiponectin SNP rs6444175 sequencing peak figure

圖4 Adiponectin SNP rs1501296測序峰值圖Fig.4 Adiponectin SNP rs1501296 sequencing peak figure

2.5 病例組和對照組Adiponectin等位基因頻率比較 等位基因水平研究結果顯示，病例組與對照組比較，Adiponectin基因rs6444175G/A等位基因A在病例組中攜帶頻率明顯高于對照組，當個體攜帶A等位基因時，病例組的相對患病風險率顯著增加至1.481倍(OR=1.481;95%CI:1.219～1.910;P=0.000)(見表5)。

2.6 維、漢族人群病例組和對照組 Adiponectin等位基因頻率比較 維、漢族人群中病例組與對照組比較發現，Adiponectin各位點等位基因頻率分布未見明顯差異，均無統計學意義(見表6)。

表2 病例組與對照組Adiponectin基因型頻率比較〔n(%)〕Tab.2 Comparison of Adiponectin genotype frequency in cases and controls〔n(%)〕

表3 rs6444175GA基因型條件Logistic回歸校正結果Tab.3 Results of rs6444175GA genotypes of conditional Logistic regression calibration

表4 維、漢族病例組和對照組Adiponectin基因型頻率比較［n(%)］Tab.4 Comparison of Adiponectin genotype frequency in Uygur，Han case and control groups［n(%)］

表5 病例組和對照組Adiponectin等位基因頻率比較Tab.5 Comparison of Adiponedtin allele frequency in case and control group

表6 維、漢族病例組和對照組Adiponectin等位基因頻率比較Tab.6 Comparison of frequency of Adiponectin allele on Uygur and Han case and control groups

3 討論

現代分子生物遺傳學證實多數疾病都是由特定的基因來調控的，本次研究選取與腦卒中相關糖脂代謝相關的基因，即脂聯素基因，通過分析脂聯素SNP rs182052、rs6444175、rs1501296位點的相關性，試圖找尋其與缺血性腦卒中之間的關系，并篩查其產生的基因型及等位基因與疾病的敏感度，并從維漢民族缺血性腦卒中的基因型特點上探討其基因位點有無差異。

3.1 維、漢民族脂聯素基因多態性與缺血性腦卒中危險因素之間的關系 Adamczak等［10］首次報道了脂聯素與原發性高血壓(EH)之間的關系，結果顯示EH患者脂聯素水平明顯低于正常對照組，在所有研究對象中血清脂聯素水平與血壓水平呈負相關，推論脂聯素可能與高血壓的臨床進程有一定的關系。研究表明，高血壓患者血漿脂聯素水平較血壓正常者明顯降低，并與收縮壓、舒張壓和平均動脈血壓均成負相關，脂聯素是發生高血壓的獨立危險因素。相關研究提示脂聯素T45G多態性與T2DM的相關性可能存在種族差異［11］，新疆維吾爾族的T2DM高發是漢族的2倍，其SNP276多態性位點與T2DM相關;2型糖尿病患者血漿脂聯素濃度明顯低于正常人群，血漿脂聯素水平降低與胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙的病理生理改變具有一定的相關性，脂聯素是糖尿病發生發展的重要生物學標志物［12，13］。何慧婧等［14］研究發現脂聯素基因SNP 45多態性與涼山州漢族居民2型糖尿病的關聯尚不確定。Bang等［15］對231例腦梗死患者的研究發現，代謝異常的患者血清脂聯素水平較低(P=0.002)，而且卒中類型不同血清脂聯素水平亦不相同。楊秀娟等［16］收集動脈粥樣硬化性腦梗死患者的血標本，發現276G/T多態性可能參與中國湖南漢族人群動脈粥樣硬化性腦梗死的發生，且可能影響血脂水平;Chen等［17］研究證實:APN通過NF-κB信號通路起到明顯抗炎效應，降低腦缺血再灌注損傷，表明具有神經保護作用，APN是潛在的治療缺血性腦梗死的分子靶點。脂聯素還可通過提高肝臟合成高密度脂蛋白而促進膽固醇的逆行轉運，高密度脂蛋白除具有膽固醇逆轉運功能外，還具有抗氧化和抗炎癥作用。

3.2 維、漢族缺血性腦卒中脂聯素基因多態性分析

本次研究納入了維族和漢族人群，使用SNaPshot技術檢測脂聯素基因3個 SNP位點:rs182052、rs6444175、rs1501296，研究發現SNP位點均呈二態性分布。其中維族Adiponectin基因SNP rs182052位點，在整組人群中，CT型占絕大比例，TT型為最少;rs6444175位點中以 GA型最多，AA型最少;rs1501296位點，以AA型居多，GG最少，但3個位點病例組和對照組均無明顯差異。其中漢族Adiponectin基因 SNP rs182052位點，在整組人群中，CT型占絕大比例，TT型為最少;rs6444175位點中以GG型最多，AA型最少;rs1501296位點，以GA型居多，GG最少，但3個位點病例組和對照組均無明顯差異。Adiponectin基因SNP rs182052位點等位基因，維、漢族人群均以 C等位基因為主;rs6444175位點等位基因，兩組均以G等位基因居多;rs1501296位點等位基因，整組人群均以A等位基因為主，但均未見顯著差異。本研究首次報告了新疆維、漢族缺血性卒中人群ADP基因多態性，此次的研究工作，發現脂聯素3個SNP位點的基因型、等位基因頻率均未見明顯差異，原因考慮可能與樣本量較少和對缺血性卒中的納入標準存在差別有關，需進一步做深入研究。

3.3 病例組與對照組脂聯素基因多態性分析 研究病例組與對照組兩組對象發現rs6444175G/A位點基因頻率分布有統計學差異(χ2=13.882，P=0.001)，由于病例組rs6444175G/A基因型GA頻率(44.3%)高于對照組(23.1%)，因此對rs6444175G/A位點GA基因型行進一步統計學處理，和基因型GG、AA比較，GA基因型頻率病例組明顯高于對照組，應用條件Logistic回歸校正傳統危險因素后，差異有統計學意義(OR=1.269;95%CI:1.001～1.952;P=0.012)，提示 rs6444175GA基因型是缺血性腦卒中的獨立危險因素，患缺血性腦卒中的風險率增加至1.269倍。通過對病例組人群脂聯素的3個SNP位點的等位基因頻率進行研究，發現部分差異:病例組人群中 Adiponectin SNPrs6444175等位基因 A頻率高于對照組，P=0.000，OR=1.481，可能為缺血性腦卒中的易感基因位點。說明缺血性腦卒中患者存在著明顯的基因位點變異。

綜上所述，通過研究發現，缺血性腦卒中Adiponectin基因rs6444175G/A等位基因A可能是其發病的易感基因位點，而維漢民族之間，雖然在基因型分布上兩組人群未存在顯著差異，但在基因位點發現不同SNP位點基因型，存在顯著差異，具有統計學意義，說明兩組人群存在一定的民族異質性，這種差異可能需要我們在以后的研究中進一步尋找相關的基因位點進行研究，脂聯素基因位點多態性差異應該是維、漢民族腦卒中發病的重要危險相關因素。本研究對新疆地區維吾爾族和漢族在缺血性卒中患者ADP基因的多態性進行分析，探討了其與缺血卒中的關系。發病上可能有不同的遺傳易感因素，但對ADP基因與缺血卒中的確切關系以及它是如何與其他致病基因相互作用引發缺血卒中的，仍有待進一步研究。

［1］張 歡，莫興波.脂聯素基因單核苷酸多態性與腦卒中和高血壓相關性的薈萃分析［J］.中國分子心臟病學雜志，2012，12(3):136-139.

［2］李曉霞，關紅軍，魯俊華，等.脂聯素水平與腦卒中關系Meta分析［J］.中國公共衛生，2010，26(1):82-84.

［3］胡曉波，倪培華，季慧峰，等.脂聯素基因-3971A/G多態性與腦梗死關系的研究［J］.中國實驗診斷學，2010，14(5):668-672.

［4］Liu M，Liu F.Transcriptional and post-translational regulation of adiponectin［J］.Biochem J，2010，425(1):41-52.

［5］Ziemke F，Mantzoros CS.Adiponectin in insulin resistance:lessons from translational research［J］.Am J Clin Nutr，2010，91(1):258S-261S.

［6］Deng G，Long Y，Yu YR，et al.Adiponectin directly improves endothelial dysfunction in obese rats through the AMPK-eNOS pathway［J］.Int J Obes，2010，34(1):165-171.

［7］Ohashi K，Parker JL，Ouchi N，et al.Adiponectin promotes macrophage polarization toward an anti-inflammatory phenotype［J］.J Biol Chem，2010，285(9):6153-6160.

［8］Sasaki M，Otani T，Kawakami M，et al.Elevation of plasma Retinolbinding protein 4 and reduction of plasma adiponectin in subjects with cerebral infarction［J］.Metabolism，2010，59(4):527-532.

［9］中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南［J］.中華神經科雜志，2010，43(2):146-153.

［10］Adamczak M，Wiecek A，Funahashi T，et al.Decreased plasma adiponectin concentrations in patients with essential hypertension［J］.Am J Hypertens，2003，16(1):72-75.

［11］康 莊，孫朝昆，趙惠珠，等.大理白族、漢族2型糖尿病與脂聯素基因多態性的相關性研究［J］.中國糖尿病雜志，2008，16(12):718-720.

［12］Sattar N.Biomarkers for diabetes prediction，pathogenesis or pharmacotherapy guidance Past，present and future possibilities［J］.Diabet Med，2012，29(1):5-13.

［13］Kishida K，Funahashi T，Shimomura I.Molecular mechanisms of diabetes and atherosclerosis:role of adiponectin［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2012，12(2):118-131.

［14］何慧婧，衛大英，王淳秀，等.四川涼山漢族2型糖尿病與脂聯素基因多態性［J］.中國公共衛生，2012，28(3):302-304.

［15］Bang OY，Saver J L，Ovbiagele B，et al.Adiponectin levels in patients with intracranial atherosclerosis［J］.Neurology，2007，68(22):1931-1937.

［16］楊秀娟，許宏偉，袁 寧，等.湖南漢族人群脂聯素基因多態性分布及其與動脈粥樣硬化性腦梗死和相關危險因素的關系［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(11):905-909.

［17］Chen B，LiaoW Q，Xu N，et al.Adiponectin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through anti-inflammatory action［J］.Brain Res，2009，1273(1):129-137.