熱量限制對C57小鼠學習記憶能力及胰島素信號通路相關蛋白的影響

趙志煒 馬麗娜 王 蓉 張 旭 王玉蘭 吳燕川 陳 娟 張景燕

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室北京市老年病醫療研究中心北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所神經變性病教育部重點實驗室，北京100053)

熱量限制(caloric restriction，CR)是指在沒有營養 不良的情況下，限制自由攝取的食物量，在1935年最早被發現［1］。熱量限制已被證實能夠延長多種生物的壽命，并且有研究［2］發現能夠減緩與老化相關的生理機能的下降。雖然目前研究發現很多信號通路參與到熱量限制的過程中，但是熱量限制有益效應的具體機制仍不明確。本實驗室前期研究［3］中發現熱量限制能夠改善糖脂代謝，而有研究［4］發現熱量限制具有神經保護作用，因此，本研究通過觀察不同熱量飲食對小鼠學習記憶和腦內胰島素信號通路的影響，進一步探討熱量限制對小鼠學習記憶影響的具體機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57小鼠30只，體質量19～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2006-009。小鼠基礎飼料適應性喂養1周后，采用數字表法將動物隨機分成3組:正常對照組(喂食普通飼料)，高能量組(喂食高能量飼料)，低能量組(喂食低能量飼料)，每組10只，單籠喂養，自由飲水，飼養于SPF級動物實驗室。

1.2 儀器與試劑

小鼠Morris水迷宮箱(DMS-2型，中國醫學科學院藥物研究所);冷凍切片機(德國Leika公司);脫色搖床(江蘇TS-1型);普通光學顯微鏡(日本OLYMPUS BH-2型)。

1.3 Morris水迷宮實驗

喂養6個月后，進行Morris水迷宮測試。Morris水迷宮系統由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動采集和處理分析系統組成。水池直徑100 cm，池高50 cm，池壁標有東南西北4個入水點，將水池等分為4個象限，分別稱SW、NW、SE及NE象限。水深30 cm，于水下2 cm處NW象限中央(最后1 d除外)、距離池壁30 cm的固定部位放置一直徑9 cm、高28 cm的柱形透明有機玻璃站臺，池壁黑色，充滿水時動物視覺無法辨認池內有無站臺。水池上方安置帶有顯示系統的攝像機，同步記錄小鼠運動軌跡，將其輸入計算機內，通過軟件分析，得到實驗數據。迷宮外參照物訓練期間保持不變。

實驗共進行6 d，前2 d訓練，后4 d測試，測試包括兩部分:1)定位航行實驗(place navigation):歷時5 d，第1、2天上、下午各訓練1次，入池位置為站臺所對象限及所鄰象限，于象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水。120 s未找到站臺者，由測試者將其引至站臺，放置30 s。第3～5天重復以上操作，若120 s仍不能找到站臺，則以120 s計算，不再進行引導。從第3天開始，記錄找到平臺所用時間(即逃避潛伏期)、游泳距離等指標。此試驗用于檢測小鼠的空間學習和記憶能力。

2)空間探索實驗(spatial probe):定位航行試驗結束后，第6天撤除平臺，將小鼠從站臺所對象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水，記錄小鼠120 s內在無平臺的水迷宮中第1次穿越平臺所在位置時間和在平臺所在象限游泳距離及穿越平臺次數。此實驗用于檢測小鼠對平臺位置的記憶。

1.4 固定取材及冰凍切片

喂養6個月后，每組各取5只小鼠于末次行為學測試后灌殺。小鼠用10%(體積分數)的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將其仰臥于平臺上，伸展固定四肢，打開胸腔及腹腔充分暴露心臟和肝臟。剪開左側心尖部，經左心室插管入主動脈并固定，同時剪開右心耳。快速灌注0.9%(質量分數)氯化鈉注射液150 mL左右，快速沖洗，待血液沖洗干凈至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體后，換用含4%(質量分數)多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)，先快速再緩慢灌注150 mL左右至小鼠肝臟變硬肢體僵直，即固定完成。然后斷頭，完整取出鼠腦后投入含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中后固定。至腦下沉后，換一次后固定液，即可行冰凍切片。

將固定好的小鼠腦組織修塊，置于少量異戊烷凍存管中，再放入液氮中冷凍10 s左右，迅速放入冰凍切片機艙內，溫度-25℃，包埋鼠腦，片厚20 μm，用于免疫組織化學染色，每只小鼠于海馬出現后連續冠狀切片。將切片放入盛有0.01 mol/L PBS溶液的24孔板內，浮片法進行免疫組織化學染色。

1.5 免疫組織化學染色(漂片法)

每組選擇6張冰凍切片(厚20 μm)，PBST洗，5min×3次，用3%H2O2室溫孵育10 min;PBST洗，5 min×3次，用與二抗相同來源動物的濃度為5% ～10%(質量分數)的封閉用正常血清(此實驗中為正常山羊血清)封閉非特異性抗原30 min，加入適當稀釋的一抗，4℃過夜;PBST洗，5 min×3次，加入生物素標記的適當稀釋的二抗室溫孵育2 h;PBST洗，5 min×3次，加入適當稀釋的鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化酶三抗，室溫孵育2 h;PBST洗，5 min×3次，DAB顯色，鏡下控制顯色程度，自來水終止顯色反應。撈片;用二甲苯透明，中性樹膠封片。

陰性對照分別以洗液和非免疫的正常山羊血清代替一抗進行免疫組織化學染色，其余步驟同前。陽性反應為組織細胞內呈棕黃色染色。

每組小鼠例數為5只，每只取6張相應部位的腦切片，共取30張切片，用顯微鏡觀察海馬部位的神經細胞形態，并于10倍物鏡下計數海馬的陽性細胞數。

1.6 統計學方法

使用SPSS 16.0進行統計處理。計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析及重復資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 飲食限制對空間學習、記憶的影響

在用Morris水迷宮測試小鼠空間學習記憶能力試驗中，將小鼠游泳逃避潛伏期和游泳距離作為學習記憶的指標進行對比。由表1可以看出，與正常組相比，高能量組和低能量組差異無統計學意義(F=0.979，P=0.389)，但高能量組逃避潛伏期時間有明顯增長趨勢，低能量組逃避潛伏期時間有明顯縮短趨勢，與高能量組相比，低能量組第3天、第4天、第5天逃避潛伏期都有不同程度的縮短。

表1 Morris水迷宮逃避潛伏期Tab.1 Escape latency of Morris test (s)

由表2可以看出，對游泳距離進行統計學分析，與正常組相比，高能量組游泳距離長，低能量游泳距離短，但各組之間比較，差異無統計學意義(F=1.286，P=0.293);與高能量組相比，低能量組第3天游泳距離明顯縮短(P＜0.05)，低能量組第4天、第5天游泳距離與高能量組相比都有不同程度的縮短。

表2 Morris水迷宮游泳距離Tab.2 Swimming distance of Morris (mm)

與正常組相比，高能量組和低能量組差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 免疫組織化學法檢測小鼠海馬神經元SIRT1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB 的表達

由表3可以看出，與正常組相比，低能量組SIRT1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB 降低(P＜0.01)，高能量組PI3K、Akt/PKB降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

熱量限制是一種有計劃地減少由食物供給的熱量，一般是在保證足夠的維生素和礦物質水平下，將正常自由進食的熱量減去30%～50%。研究［2-5］顯示熱量限制可以預防或減緩年齡相關的病理變化。熱量限制具有神經保護作用，因此可以延緩對神經退行性疾病例如阿爾茨海默病的進展［6-7］。但熱量限制對于學習記憶能力的影響及其機制目前少有研究。

表3 各組動物免疫組化結果Tab.3 Immunohistochemistry of the three groups

本研究采用Morris水迷宮測試小鼠空間學習記憶能力，研究顯示高能量組逃避潛伏期時間有明顯增長趨勢，低能量組逃避潛伏期時間有明顯縮短趨勢;與高能量組相比，低能量組第3天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。提示熱量限制能夠改善小鼠的學習記憶能力。Morris水迷宮發明于20世紀80年代初，它能比較客觀地衡量動物空間記憶，工作記憶及空間辨別能力的改變，是檢測實驗動物學習記憶的重要工具，由于其簡便易行，檢測結果客觀，而廣泛用于空間學習記憶功能的研究［8］。因此，本研究采用Morris水迷宮來評價飲食限制對小鼠空間學習記憶能力的影響。本研究結果顯示，與正常組相比，高能量組小鼠逃避潛伏期和游泳距離雖無統計學差異但都有所延長，提示高能量組小鼠存在一定的學習記憶障礙。

本研究顯示低能量組小鼠腦內胰島素信號通路相關蛋白煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白脫乙酰酶(silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)、磷脂肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt/PKB)、磷酸化應答原件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，p-CREB)的表達均明顯降低(P＜0.01)。胰島素是人體胰島分泌的重要激素，不僅參與能量代謝的調節，對神經細胞還具有營養支持和抗凋亡的作用。它能促進神經元增殖和樹突芽生，在應激狀態下保護神經元，增強學習和記憶能力，與中樞的學習和記憶功能密切相關。胰島素作用是通過與相應的受體結合激活不同的信號通路來實現的。因此研究胰島素信號轉導通路對學習記憶尤為重要。目前胰島素信號通路主要有3條:磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)PI3K/AKT通路、細胞外調節蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路和磷脂酶 C(phospholipase，PLC)途徑。本研究重點在于觀察PI3K/AKT通路蛋白表達的變化，觀察的靶蛋白主要包括 SIRT-1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB等指標。胰島素在體內發揮作用機制復雜，胰島素到達相應的靶細胞以后，與靶細胞膜表面的胰島素受體(insulin receptor，IR)的α亞基結合，激活β亞基，導致受體自動磷酸化，從而引起胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)的酪氨酸磷酸化，磷酸化的IRS-1可激活PI3K，引起PI3K的活性升高，使 Akt/PKB磷酸化，最終可使CREB磷酸化，促使基因轉錄和神經元存活以及胰島素的其他功能［9］。但仍有研究［10-11］顯示熱量限制對認知行為沒有影響或者使其下降，因此，熱量限制對學習記憶功能的影響存在很多爭議［12-14］，但是不同研究的不同結果的原因可能由于實驗條件、動物種系及測量學習記憶功能方法的不同。本研究對于熱量限制改善學習記憶功能提供了機制方面的證據支持，關于熱量限制與胰島素信號通路及其他信號通路更深入的關系仍待于進一步的研究。

總之，熱量限制可以提高C57小鼠的學習記憶功能，并且改善腦內胰島素信號通路，由此提示熱量限制可能通過改善腦內胰島素信號通路從而提高學習記憶功能，從而為治療年齡相關的疾病例如阿爾茨海默病提供可能的治療方案。

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