不同年齡段人群蛋白質N-糖基的結構譜型研究

劉相佟 王友信 楊興華 董 晶 王 嵬 郭秀花*

(1.首都醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，北京100069;2.臨床流行病學北京市重點實驗室，北京100069;3.首都醫科大學宣武醫院健康體檢科，北京100053;4.埃迪斯科文大學醫學科學院，珀斯6027，澳大利亞)

糖基化(glycosylation)是指蛋白質或脂質在酶的作用下被連接上糖鏈的過程。作為生物體內最為重要的蛋白質翻譯后修飾形式之一，糖基化調控了蛋白質在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣［1-2］。細胞內超過50%的蛋白質都修飾有糖鏈，它們參與細胞識別、細胞分化、發育、信號轉導、免疫應答等在內的各種重要的生命活動。多種疾病如腫瘤、代謝性疾病、心血管病、免疫性疾病及感染性疾病的發生、發展過程均伴隨著蛋白質糖基化異常的發生［3-4］。所以，針對糖鏈形成、糖鏈結構和糖鏈功能的糖生物學研究有助于深入認識生命現象的本質、闡明疾病發生機制、以及為疾病的早期診斷和治療提供指導，已成為當前生命科學不可忽視的領域。

根據結合位點和結構的差異，糖鏈分為以下幾種類型:N-連接糖鏈、O-連接糖鏈、C-連接糖鏈等。其中，N-連接糖鏈最為常見，在真核生物中廣為存在，值得深入研究。N-連接糖蛋白主要定位于細胞膜表面，其合成在內質網和高爾基體中進行。糖鏈中寡糖殘基的種類和個數、糖基鍵的類型構成了糖鏈的長度和構型差異，從而形成了糖鏈的多樣性。國外已有研究［5］顯示人體血漿N-糖基濃度可能存在性別及年齡決定性，但國內當前對此研究較少，尤其缺乏一般人群的基礎信息數據。因此，本研究檢測了首都醫科大學宣武醫院進行健康體檢212名研究對象的N-糖基的結構譜型，并對不同年齡進行比較分析，為深入開展疾病與糖基化的關聯性研究提供基礎資料。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

以2009年4至7月在首都醫科大學宣武醫院進行健康體檢調查的212名居民為研究對象，嚴格按照納入、排除標準，最終篩選出符合標準的的212名居民為研究樣本，收集人口學信息、體格檢查和實驗室檢查結果，并進行實驗室糖基組學檢測。

1.2 方法

1.2.1 體格檢查

由經過統一培訓的調查員按照統一的方法，測量入選者血壓、身高、體質量。血壓按照美國心臟聯合會推薦的方法采用同一水銀柱血壓計測量2次，取平均值進行統計分析。被測者測量前1 h內避免劇烈運動以及進食、喝含咖啡因的刺激性飲料，測量前30 min停止吸煙，精神放松，排便、排尿。被測者休息至少5 min后坐位，雙足平放地上，暴露右側手臂，平置在桌上，使得肘窩與心臟基本等高。袖帶緊貼被測者右臂上纏繞，袖帶中心的高度與心臟基本平起，袖帶下緣應等高于被測者肘窩上方1～2 cm，進行測量。2次測量中間間隔不少于30 s。被測者脫去鞋、帽，取立正姿勢，雙眼平視前方，頸部、軀干、胯部和膝關節要充分伸直，兩臂自然下垂，腳跟并攏，腳尖分開約60度。測試者站在側面，將身高計的水平板輕輕沿著立柱下滑直到接觸受試者頭頂，這時水平板所指的刻度，即為身高。記錄身高和體質量的結果，分別精確到1 cm和0.5 kg。

1.2.2 樣品采集及處理方法

研究對象晨起空腹抽外周靜脈進行血常規、血糖、血脂等項目的檢查。使用乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)真空采血管采集肘部外周靜脈血液樣本用于N-糖基組學分析。血液樣本采集后置于冰盒中進行樣本的運送。到達實驗室后，將采血管從冰盒中取出，按照樣本編號順序、平穩地置于1.5 mL離心管架上，在室溫下靜置10 min左右。然后，進行血漿樣本分離，常溫3 000 r/min離心10 min，迅速吸取上層血漿樣本100 μL左右(根據離心后，上層血漿量而定)，分裝于3個1.5 mL離心管，置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.2.3 血漿N-糖基結構檢測方法

本研究采用高效液相色譜儀Alliance 2695(美國Waters公司)對血漿N-糖基進行高通量檢測，該方法的簡要流程為:5 μL的血漿樣本置于96孔板中，采用多肽 N-糖苷酶(peptide N-glyeosidase F，PNGase F)將與蛋白質結合的糖鏈消化下來。然后，采用2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide，2-AB)進行熒光標記，標記的糖鏈真空干燥，在使用前用水溶解;標記的樣本使用親水相互作用色譜在30℃、進行60 min的分析，可以得到16個包含糖鏈結構的色譜峰區域。根據色譜峰內包含糖基結構的GU(glycan unit)單位與數據庫(http:∥glycobase.nibrt.ie)比對后確定糖基組組成和含量。然后，2-AB標記的N-糖鏈通過唾液酸酶處理，切除α2-3、α2-6和α2-8連接的唾液酸，然后用親水相互作用色譜進行分析，最終得到13個去唾液酸的糖鏈色譜峰。N-糖鏈采用弱陰離子交換色譜(weak anion exchange-HPLC，WAX-HPLC)的方法進行檢測:糖鏈經Prozyme GlycoSep C 75 mm×7.5 mm色譜柱(美國Anachem公司)進行分析，N-糖鏈按照含有唾液酸的數量而分離出4種糖基結構(包括monosialylated，disialylated，trisialylated，tetrasialylated 糖基化修飾的糖基結構)。

1)正相高效液相色譜分析:(1)色譜柱:TSKgel Amide-80 5 μm 250 mm × 4.6 mm 色 譜 柱(美 國Anachem公司)，用于180、120或60 min的分析。(2)條件:分析溫度為30℃。(3)試劑:pH 4.4 50 mmol/L蟻酸(美國Merck公司)與氨水(美國Sigma公司)混合，作為溶劑A;乙腈(美國J.T.Baker公司)作為溶劑B。(4)儀器:180、120或30 min分析采用的是具有吸收、激發波長分別為330 nm和420 nm熒光探測儀(美國Waters公司)的Alliance 2695分離系統。

2)弱陰離子交換色譜分析:(1)色譜柱:糖鏈經Prozyme GlycoSep C 75 mm×7.5 mm色譜柱(美國Anachem公司)進行分析。(2)條件:分析溫度為30℃。(3)試劑:20%乙腈(美國J.T.Baker公司)作為溶劑A，Ph7.0 0.1 mmol/L蟻酸(美國Merck公司)與氨水(美國Sigma公司)混合，溶于20%乙腈(美國J.T.Baker公司)作為溶劑B。

最終，每一個色譜峰(glycan peak，GP)所對應的面積采用所占全部糖基組色譜面積的相對百分數表示，如GP1至 GP16的16個色譜峰面積的總和是100%，每個色譜峰的面積是該色譜峰占總色譜峰面積的百分數。將具有相同特點的色譜峰進行合并計算，得到特定N-糖基結構的血漿含量［6］。

1.3 納入和排除標準

納入標準:①年齡在18歲以上;② 自愿參加此次研究。排除標準:①婦女妊娠期;②查體者近期曾服用甲狀腺素、雌激素、噻嗪類利尿藥、β-受體阻斷劑、苯妥英鈉以及口服避孕藥等影響血脂的藥物;③患有甲狀腺功能亢進或減退、皮質醇增多癥、垂體瘤等內分泌疾病可影響血脂者;④腎功能不全者。

1.4 質量控制

①嚴格按照研究對象的納入、排除標準進行研究對象的選擇;②調查前，血壓計、身高、體質量計的校正;③ 研究人員統一培訓，包括血壓測量方法、身高、體質量的檢查方法等;④ 采集的血液樣本及時采用干冰進行冷藏運送，取回后在實驗室進行及時處理，置于-80℃低溫冰箱保存;⑤所有數據進行雙錄入，檢查數據的邏輯錯誤、異常值及缺失值等。

1.5 統計學方法

采用SAS9.2軟件進行統計分析，由于樣本含量n≤2 000，正態性檢驗采用Shapiro-Wilk(W檢驗)，正態分布資料以均數、標準差描述，不同年齡的比較采用兩獨立樣本t檢驗;非正態分布資料以中位數(Median)、四分位數間距描述，不同年齡的比較采非參檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人口學指標

212名體檢者的平均年齡為(37.78±17.89)歲。其中，男性99人(46.70%)，平均年齡為(34.10±14.37)歲;女性 113人(53.30%)，平均年齡為(41.01±19.99)歲。

2.2 不同年齡人群N-糖基的結構譜型分布

分年齡對血漿N-糖基含量的分布進行正態性檢驗，結果顯示，兩年齡組均符合正態分布的為:二半乳糖聚糖(digalactosylated glycans，G2)、四半乳糖聚糖(tetragalactosylated glycans，G4)、單唾液酸化雙觸角聚糖(monosialylated biantennary glycans，BAMS)、二唾液酸化雙觸角聚糖(disialylated biantennary glycans，BADS)、單唾液酸聚糖(monosialylatedglycans，Monosialo)、二唾液酸聚糖(disialylatedglycans，Disialo)、核心巖藻糖化聚糖(core-fucosylated glycans，FUC_C)、雙觸角聚糖(biantennary glycans，BA)、四觸角聚糖(tentraantennary glycans，TA)(P ＞0.05)。對總體進行正態性檢驗，符合正態分布的為:單半乳糖聚糖(monogalactosylated glycans，G1)、四半乳糖聚糖(G4)、單唾液酸化雙觸角聚糖(BAMS)、二唾液酸化雙觸角聚糖(BADS)、單唾液酸聚糖(Monosialo)、二唾液酸聚糖(Disialo)、核心巖藻糖化聚糖(FUC_C)、雙觸角聚糖(BA)、四觸角聚糖(TA)(P＞0.05)，不服從正態分布的有:非半乳糖聚糖(non-galactosylated glycans，G0)、二半乳糖聚糖(G2)、三半乳糖聚糖(trigalactosylated glycans，G3)、雙觸角非半乳糖聚糖(biantennary nongalactosylated glycans，A2)、三唾液酸聚糖(Trisialylatedglycans，Trisialo)、四唾液酸聚糖(tetrasialylatedglycans，Tetrasialo)、核心巖藻糖化聚糖(antennary fucosylated glycans，FUC_A)、三觸角聚糖(triantennary glycans，TRIA)(P ＜0.05，表1)。

2.3 同性別不同年齡的N-糖基結構比較

對于男性，年齡＜35歲男性，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(81.01±2.17)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.29±0.31);對于年齡≥35歲組，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(82.15±2.05)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.23±0.25)。不同年齡組比較，＜35歲男性血漿二唾液酸化雙觸角聚糖(BADS)、四觸角聚糖(TA)、雙觸角非半乳糖聚糖(A2)、三唾液酸(Trisialo)和三觸角聚糖(TRIA)含量較高(P＜0.05);≥35歲男性者血漿二半乳糖聚糖(G2)、單唾液酸(Monosialo)、核心巖藻糖化聚糖(FUC_C)和雙觸角聚糖(BA)含量較高(P﹤0.05)(表2、3)。

對于女性，年齡＜35歲組，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(81.77±1.74)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.31±0.28);對于年齡≥35歲女性，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(82.74±2.03)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.26±0.24)。不同年齡組比較，＜35歲組女性的血漿二唾液酸化雙觸角聚糖(BADS)、四觸角聚糖(TA)、非半乳糖聚糖(G0)、三

半乳糖聚糖(G3)、雙觸角非半乳糖聚糖(A2)、三唾液酸(Trisialo)和三觸角聚糖(TRIA)含量較高(P＜0.05);≥35歲組女性的血漿二半乳糖聚糖(G2)、單唾液酸化雙觸角聚糖(BAMS)、單唾液酸(Monosialo)、核心巖藻糖化聚糖(FUC_C)和雙觸角聚糖(BA)含量較高(表4、5)。

表1 17種N-糖基結構的含量分布正態性檢驗結果Tab.1 Results of normality test for 17 N-glycans distribution

表2 男性不同年齡的正態分布血漿N-糖基結構的比較Tab.2 Comparison of normal distribution plasma N-glycans between age groups for males

表3 男性不同年齡的偏態分布血漿N-糖基結構的比較Tab.3 Comparison of non-normal distribution plasma N-glycans between age groups for males

表4 女性不同年齡的正態分布血漿N-糖基結構的比較Tab.4 Comparison of normal distribution plasma N-glycans between age groups for females

表5 女性不同年齡的偏態分布血漿N-糖基結構的比較Tab.5 Comparison of non-normal distribution plasma N-glycans between age groups for female

3 討論

21世紀，作為一個全球面臨的重大挑戰，人口的老齡化引起了越來越多的關注。隨之，與老齡化相關的病理生理學進展、遺傳學機制研究應運而生［5］。并且，糖基組學研究已經成為繼基因組學、蛋白組學、代謝組學、脂質組學后的新興研究熱點。肺癌、結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤標志物的糖基組學尤其以 N-糖基化研究［7-12］較多，但國內的研究［13-16］相對較少，對健康人群糖基組學的研究探索更是罕見。因此，糖生物學與年齡的關聯研究逐漸成為熱點。

本研究顯示，對于血漿N-糖基分布的分析顯示，總體符合正態分布的有:單半乳糖聚糖、四半乳糖聚糖、單唾液酸化雙觸角聚糖、二唾液酸化雙觸角聚糖、單唾液酸、二唾液酸、三唾液酸、核心巖藻糖化聚糖、雙觸角聚糖和四觸角聚糖。兩年齡組均符合正態分布的為:二半乳糖聚糖、四半乳糖聚糖、單唾液酸化雙觸角聚糖、二唾液酸化雙觸角聚糖、單唾液酸、二唾液酸、核心巖藻糖化聚糖、雙觸角聚糖和四觸角聚糖。這提示在實際臨床應用中，醫學參考值范圍的計算方法應由某種糖基含量在具體人群的分布決定。

不論是總體，還是2年齡組，N-糖基相對含量最高均為雙觸角聚糖，最低為四半乳糖聚糖。這說明，研究對象血漿四半乳糖聚糖糖基化相對含量最低，而雙觸角聚糖則為最普遍的糖基，這與之前的研究［17］結果相似。

無論男性女性，半乳糖基化水平，≥35歲組二半乳糖聚糖含量較高、雙觸角非半乳糖聚糖含量較低;在兩分支糖基的唾液酸化水平，＜35歲組二唾液酸化雙觸角聚糖含量較高;在唾液酸化水平，≥35歲組單唾液酸含量高、三唾液酸較低。≥35歲組巖藻糖基化位置，核心巖藻糖化聚糖含量高。以上結果說明血漿N-糖基結構水平可能與年齡有關，與國內外研究［18-21］相似，這提示不論種族，相應糖基結構應納入到老齡化的機制研究中。而在分支水平，≥35歲組雙觸角聚糖含量較高，三觸角聚糖和四觸角聚糖含量較低，這與Ding等［5］對中國北方人群的研究結果相似，可以開展大樣本隊列或縱向研究進一步探討。

通過對血漿N-糖鏈的結構檢測發現17個糖基結構，這些糖基結構的發現為下一步特異糖鏈的結構解析奠定了基礎，并為糖鏈的結構與生物學功能的研究提供了新的思路。而不同年齡的糖基結構差異提示蛋白質的糖基化修飾水平可能與年齡有關，這也為大量開展蛋白質糖基化水平檢測提供基礎信息，從而為疾病的診斷預測提供科學依據。

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