中介素通過經(jīng)典Wnt信號途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

尚海，郝志強(qiáng)，傅熙博，華向東，馬作紅，艾福錄，馮照強(qiáng)，王坤，李文心，李博

（遼寧省腫瘤醫(yī)院肝膽胰科，沈陽 110042）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排第3位，惡性程度極高，至今尚無有效的治療方法，5年生存率較低，僅在30%左右。而肝癌細(xì)胞的增殖活性與其發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。小分子生物活性肽具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，結(jié)構(gòu)簡單、組織分布廣泛、生物效應(yīng)多樣，在機(jī)體調(diào)節(jié)中具有十分重要的作用。多種細(xì)胞因子和小分子多肽在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。中介素（intermedin，IMD）屬于降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）超家族，于2004年首先在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)［1］，之后人們又相繼在其他物種cDNA基因克隆中發(fā)現(xiàn)該活性肽。IMD在體內(nèi)分布廣泛，在腎上腺皮質(zhì)腫瘤［2］、直結(jié)腸癌［3］中的表達(dá)均高于正常組織，還可促進(jìn)血管新生［4］，提示IMD與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本文探討了IMD在肝細(xì)胞癌中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

重組人IMD（IMD1?53）及其受體拮抗劑（IMD17?47）購于美國Phoenix Pharmaceuticals公司；CCK?8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購于日本同仁化學(xué)公司；RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；Taq酶購于北京天根公司；Evergreen熒光染料購于美國Biotium公司；經(jīng)典Wnt通路阻斷劑IWR?1?endo購于美國Cayman公司；Wnt信號通路活性檢測TOPFlash/FOPFlash質(zhì)粒購于美國Millipore公司；JetPEI轉(zhuǎn)染試劑購于美國Polyplus?transfection公司。

1.2 CCK?8檢測細(xì)胞增殖

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×104/100 μL接種于平底96孔板，12 h后更換含不同濃度（1～100 nmol/L）IMD的RPMI 1640培養(yǎng)液，或者加入IMD 17?47、IWR?1?endo處理，以不含IMD的RPMI 1640完全培養(yǎng)液作為對照，于48 h取板，每孔加入10 μL CCK?8，孵箱內(nèi)放置1～4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的光吸收值［5］。

1.3 RNA提取

采用Promega公司的Trizol試劑：細(xì)胞吸出培養(yǎng)液后PBS洗滌，加入1 mL RNAtrip試劑反復(fù)吹打30次；移入EP管中，室溫放置10 min；加入氯仿0.2 mL，劇烈顛倒混勻15 s，室溫放置5 min；4℃、12 000 g離心15 min；小心吸出上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入等體積異丙醇充分混勻，-70℃沉淀2 h；4℃、12 000 g離心10 min。棄上清；用預(yù)冷的1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4℃、12 000 g離心10 min；棄上清，用槍頭小心洗去附在管壁上的液滴。待沉淀周圍透明、中間稍白時(shí)，加適量去RNA酶純水溶解并定量。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20 mL反應(yīng)體系，2 mg RNA起始量，使用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。實(shí)時(shí)定量PCR為25 mL反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物1 mL為模板。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72℃30 s，延伸72℃5 min。40個(gè)循環(huán)。以Strata?gene Mx3000軟件進(jìn)行分析。引物序列：人c?myc：上游 5′?TGCTCCATGAGGAGACACC?3′，下游 5′?CTTTTCCACAGAAACAACATCG?3′；人cyclin D1：上游 5′?GAAGATCGTCGCCACCTG ?3′，下 游 5′?GACCTCCTCCTCGCACTTCT?3′；人β?actin上游 5′?ATCTGGCACCACACCTTC?3′，下游 5′?AGCCAGGT CCAGACGCA?3′。

1.5 熒光素酶活性測定

HepG2細(xì)胞種植于12孔板中，以JetPEI試劑轉(zhuǎn)染0.5 μg各種質(zhì)粒后孵育24 h。之后收獲細(xì)胞并勻漿。然后以Promega公司的Dual?LuciferaseTMRe?porter Assay System 檢測熒光素酶活性［6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IMD呈劑量依賴關(guān)系性誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖

CCK?8檢測顯示，不同濃度（5～100 nmol/L）的IMD作用48 h均可以顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖（P＆lt;0.05）。見圖1。

圖1 IMD呈劑量依賴性促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖Fig.1 IMD promotes the proliferation of HepG2 cells in a dosedependent manner

2.2 IMD促HepG2細(xì)胞增殖的作用呈受體依賴性

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IMD受體的競爭性拮抗劑IMD 17?47（100 nmol/L）可顯著抑制IMD（10 nmol/L）的促增殖作用。因此，IMD可以呈劑量依賴性促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖，并且具有受體依賴性。見圖2。

2.3 IMD激活HepG2細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號通路

我們進(jìn)一步探討了IMD促HepG2細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。Wnt信號傳導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中起著非常重要的作用。我們以TOPFlash為報(bào)告質(zhì)粒，F(xiàn)OPFlash為陰性對照，以pRL?TK作內(nèi)參對照，轉(zhuǎn)染6 h后，以IMD（10 nmol/L）處理24 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測，結(jié)果顯示IMD刺激下TOP?Flash/FOPFlash比值明顯高于對照組（P＆lt;0.05，圖3A），下游靶基因c?myc與cyclin D1 mRNA水平明顯上調(diào)（P＆lt;0.05，圖3B）。說明IMD作用下經(jīng)典Wnt信號途徑被激活，轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)。

圖2 IMD受體拮抗劑抑制IMD對HepG2細(xì)胞的促增殖作用Fig.2 The proliferation of HepG2 cells induced by IMD was inhibitedby IMD receptor antagonist

圖3 IMD激活經(jīng)典Wnt信號通路Fig.3 IMD activates classical Wnt signaling pathway

2.4 Wnt信號通路抑制劑IWR?1?endo可在一定程度上抑制由IMD導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞增殖

給予Wnt信號通路抑制劑IWR?1?endo（25 μmol/L）提前處理細(xì)胞1 h后，可以顯著抑制IMD（10 nmol/L）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞增殖。因此，IMD可能通過Wnt信號通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。見圖4。

3 討論

本研究首次證實(shí)了人IMD可通過經(jīng)典Wnt信號途徑促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖。依據(jù)如下：（1）IMD處理HepG2肝癌細(xì)胞可直接引起其增殖；（2）IMD受體競爭性拮抗劑IMD17?47可阻斷上述作用；（3）IMD可激活經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)錄活性及下游靶基因mRNA水平；（4）阻斷Wnt信號途徑可在一定程度上抑制由IMD導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞增殖。

圖4 Wnt信號通路抑制劑IW R?1?endo抑制IMD對HepG 2細(xì)胞的促增殖作用Fig.4 Inhibition of Wnt signaling pathway impairs the effects ofIMD?induced HepG2 cell proliferation

IMD是CGRP超家族成員，與腎上腺髓質(zhì)素（ad?renomedullin，AM）的氨基酸結(jié)構(gòu)有30%相似性，也被稱為AM2。其前體由148個(gè)氨基酸殘基組成，有多個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)，在體內(nèi)可被剪切為IMD 1?47、IMD 8?47及IMD1?53三個(gè)活性片段［7］。CGRP家族通過與降鈣素受體樣受體/受體活化修飾蛋白復(fù)合物共同受體（calcitonin receptor?like receptor/receptor activity?modifying protein receptor complexes，CRLR/RAMPs）相結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)［8］。CGRP 主要作用于RAMP1，AM作用于RAMP2/3，而IMD無選擇性地作用于RAMP1/2/3，因此IMD可能具有更廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［1］。IMD在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及高血壓、心肌缺血、心功能衰竭和腎功能衰竭等疾病過程中的作用已有很多研究。雖然研究中發(fā)現(xiàn)IMD在腎上腺皮質(zhì)腫瘤、直結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌中的表達(dá)均高于正常對照組，但是IMD在腫瘤，尤其是肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，尚不明確。我們的研究表明，IMD有促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞增殖的作用（圖1），且這種作用是通過受體依賴性實(shí)現(xiàn)的（圖2）。自分泌假說提出，很多腫瘤細(xì)胞可通過對其本身分泌的生長因子的反應(yīng)，從而逃離生長抑制［9，10］。我們的研究也表明，在未給予外源性IMD刺激的條件下，IMD受體拮抗劑IMD17?47仍然可以抑制基礎(chǔ)水平下HepG2細(xì)胞的增殖（圖2），提示HepG2細(xì)胞本身即可以表達(dá)和分泌IMD，與Guo等［11］的研究結(jié)果相吻合。

Wnt信號傳導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中起著非常重要的作用，經(jīng)典Wnt信號通路的激活有賴于β?catenin在細(xì)胞質(zhì)中異常蓄積而后入核，通過與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（T?cell factor/lymphoid en?hancing factor，TCF/LEF）形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，調(diào)控下游靶基因如cyclin D1和c?myc的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［12，13］。研究表明，30%～40%的肝癌發(fā)生Wnt通路的失調(diào)或β?catenin基因突變；62%～70%的肝癌出現(xiàn)胞質(zhì)和胞核的β?catenin表達(dá)，在分化程度較差的肝癌細(xì)胞核內(nèi)可以看到β?catenin的表達(dá)更明顯［14～16］。c?myc是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的β?catenin/TCF復(fù)合物的下游靶基因，在細(xì)胞凋亡、增殖、代謝、DNA修復(fù)以及血管形成等各種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］；cyclin D1基因是β?catenin/TCF途徑的另一個(gè)直接靶基因，若持續(xù)高水平表達(dá)，可使細(xì)胞停留于細(xì)胞周期的S期，過度增殖進(jìn)而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［18］。我們的研究中，TOPFlash/FOPFlash熒光素酶檢測結(jié)果表明，IMD可增強(qiáng)β?catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性；且Wnt下游靶基因cyclin D1和c?myc的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯上調(diào)。提示IMD激活Wnt信號通路，進(jìn)而促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，作為CGRP超家族成員，IMD通過與受體結(jié)合，激活Wnt信號通路發(fā)揮其促肝癌細(xì)胞增殖作用，為肝癌的治療提出新的思路。IMD拮抗劑可能作為抗肝癌的治療手段之一。

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