中介素通過經典Wnt信號途徑促進肝癌細胞增殖

尚海，郝志強，傅熙博，華向東，馬作紅，艾福錄，馮照強，王坤，李文心，李博

（遼寧省腫瘤醫院肝膽胰科，沈陽 110042）

原發性肝細胞癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在惡性腫瘤中排第3位，惡性程度極高，至今尚無有效的治療方法，5年生存率較低，僅在30%左右。而肝癌細胞的增殖活性與其發生、發展、侵襲、轉移密切相關。小分子生物活性肽具有獨特的生物學特性，結構簡單、組織分布廣泛、生物效應多樣，在機體調節中具有十分重要的作用。多種細胞因子和小分子多肽在肝癌的發生、發展中起到重要作用。中介素（intermedin，IMD）屬于降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）超家族，于2004年首先在硬骨魚中發現［1］，之后人們又相繼在其他物種cDNA基因克隆中發現該活性肽。IMD在體內分布廣泛，在腎上腺皮質腫瘤［2］、直結腸癌［3］中的表達均高于正常組織，還可促進血管新生［4］，提示IMD與腫瘤的發生、發展相關。本文探討了IMD在肝細胞癌中的作用及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

重組人IMD（IMD1?53）及其受體拮抗劑（IMD17?47）購于美國Phoenix Pharmaceuticals公司；CCK?8細胞增殖檢測試劑盒購于日本同仁化學公司；RNA提取及逆轉錄試劑盒、螢光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；Taq酶購于北京天根公司；Evergreen熒光染料購于美國Biotium公司；經典Wnt通路阻斷劑IWR?1?endo購于美國Cayman公司；Wnt信號通路活性檢測TOPFlash/FOPFlash質粒購于美國Millipore公司；JetPEI轉染試劑購于美國Polyplus?transfection公司。

1.2 CCK?8檢測細胞增殖

將處于對數生長期的HepG2細胞以1×104/100 μL接種于平底96孔板，12 h后更換含不同濃度（1～100 nmol/L）IMD的RPMI 1640培養液，或者加入IMD 17?47、IWR?1?endo處理，以不含IMD的RPMI 1640完全培養液作為對照，于48 h取板，每孔加入10 μL CCK?8，孵箱內放置1～4 h，使用酶標儀測定450 nm波長的光吸收值［5］。

1.3 RNA提取

采用Promega公司的Trizol試劑：細胞吸出培養液后PBS洗滌，加入1 mL RNAtrip試劑反復吹打30次；移入EP管中，室溫放置10 min；加入氯仿0.2 mL，劇烈顛倒混勻15 s，室溫放置5 min；4℃、12 000 g離心15 min；小心吸出上層水相轉移到新EP管中，加入等體積異丙醇充分混勻，-70℃沉淀2 h；4℃、12 000 g離心10 min。棄上清；用預冷的1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4℃、12 000 g離心10 min；棄上清，用槍頭小心洗去附在管壁上的液滴。待沉淀周圍透明、中間稍白時，加適量去RNA酶純水溶解并定量。

1.4 實時定量PCR

逆轉錄反應為20 mL反應體系，2 mg RNA起始量，使用Promega公司的逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。實時定量PCR為25 mL反應體系，逆轉錄反應混合物1 mL為模板。擴增條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72℃30 s，延伸72℃5 min。40個循環。以Strata?gene Mx3000軟件進行分析。引物序列：人c?myc：上游 5′?TGCTCCATGAGGAGACACC?3′，下游 5′?CTTTTCCACAGAAACAACATCG?3′；人cyclin D1：上游 5′?GAAGATCGTCGCCACCTG ?3′，下 游 5′?GACCTCCTCCTCGCACTTCT?3′；人β?actin上游 5′?ATCTGGCACCACACCTTC?3′，下游 5′?AGCCAGGT CCAGACGCA?3′。

1.5 熒光素酶活性測定

HepG2細胞種植于12孔板中，以JetPEI試劑轉染0.5 μg各種質粒后孵育24 h。之后收獲細胞并勻漿。然后以Promega公司的Dual?LuciferaseTMRe?porter Assay System 檢測熒光素酶活性［6］。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 IMD呈劑量依賴關系性誘導HepG2細胞增殖

CCK?8檢測顯示，不同濃度（5～100 nmol/L）的IMD作用48 h均可以顯著促進HepG2細胞的增殖（P＆lt;0.05）。見圖1。

圖1 IMD呈劑量依賴性促進HepG2細胞增殖Fig.1 IMD promotes the proliferation of HepG2 cells in a dosedependent manner

2.2 IMD促HepG2細胞增殖的作用呈受體依賴性

進一步研究發現，IMD受體的競爭性拮抗劑IMD 17?47（100 nmol/L）可顯著抑制IMD（10 nmol/L）的促增殖作用。因此，IMD可以呈劑量依賴性促進HepG2細胞的增殖，并且具有受體依賴性。見圖2。

2.3 IMD激活HepG2細胞經典Wnt信號通路

我們進一步探討了IMD促HepG2細胞增殖的可能機制。Wnt信號傳導通路在腫瘤細胞的增殖過程中起著非常重要的作用。我們以TOPFlash為報告質粒，FOPFlash為陰性對照，以pRL?TK作內參對照，轉染6 h后，以IMD（10 nmol/L）處理24 h后進行雙熒光素酶活性檢測，結果顯示IMD刺激下TOP?Flash/FOPFlash比值明顯高于對照組（P＆lt;0.05，圖3A），下游靶基因c?myc與cyclin D1 mRNA水平明顯上調（P＆lt;0.05，圖3B）。說明IMD作用下經典Wnt信號途徑被激活，轉錄活性明顯增強。

圖2 IMD受體拮抗劑抑制IMD對HepG2細胞的促增殖作用Fig.2 The proliferation of HepG2 cells induced by IMD was inhibitedby IMD receptor antagonist

圖3 IMD激活經典Wnt信號通路Fig.3 IMD activates classical Wnt signaling pathway

2.4 Wnt信號通路抑制劑IWR?1?endo可在一定程度上抑制由IMD導致的HepG2細胞增殖

給予Wnt信號通路抑制劑IWR?1?endo（25 μmol/L）提前處理細胞1 h后，可以顯著抑制IMD（10 nmol/L）誘導的HepG2細胞增殖。因此，IMD可能通過Wnt信號通路促進HepG2細胞的增殖。見圖4。

3 討論

本研究首次證實了人IMD可通過經典Wnt信號途徑促進HepG2肝癌細胞的增殖。依據如下：（1）IMD處理HepG2肝癌細胞可直接引起其增殖；（2）IMD受體競爭性拮抗劑IMD17?47可阻斷上述作用；（3）IMD可激活經典Wnt信號轉錄活性及下游靶基因mRNA水平；（4）阻斷Wnt信號途徑可在一定程度上抑制由IMD導致的HepG2細胞增殖。

圖4 Wnt信號通路抑制劑IW R?1?endo抑制IMD對HepG 2細胞的促增殖作用Fig.4 Inhibition of Wnt signaling pathway impairs the effects ofIMD?induced HepG2 cell proliferation

IMD是CGRP超家族成員，與腎上腺髓質素（ad?renomedullin，AM）的氨基酸結構有30%相似性，也被稱為AM2。其前體由148個氨基酸殘基組成，有多個蛋白酶切位點，在體內可被剪切為IMD 1?47、IMD 8?47及IMD1?53三個活性片段［7］。CGRP家族通過與降鈣素受體樣受體/受體活化修飾蛋白復合物共同受體（calcitonin receptor?like receptor/receptor activity?modifying protein receptor complexes，CRLR/RAMPs）相結合發揮效應［8］。CGRP 主要作用于RAMP1，AM作用于RAMP2/3，而IMD無選擇性地作用于RAMP1/2/3，因此IMD可能具有更廣泛的生物學效應［1］。IMD在內環境穩態調節以及高血壓、心肌缺血、心功能衰竭和腎功能衰竭等疾病過程中的作用已有很多研究。雖然研究中發現IMD在腎上腺皮質腫瘤、直結腸癌、胰腺癌、乳腺癌中的表達均高于正常對照組，但是IMD在腫瘤，尤其是肝癌發生發展中的作用，尚不明確。我們的研究表明，IMD有促進HepG2肝癌細胞增殖的作用（圖1），且這種作用是通過受體依賴性實現的（圖2）。自分泌假說提出，很多腫瘤細胞可通過對其本身分泌的生長因子的反應，從而逃離生長抑制［9，10］。我們的研究也表明，在未給予外源性IMD刺激的條件下，IMD受體拮抗劑IMD17?47仍然可以抑制基礎水平下HepG2細胞的增殖（圖2），提示HepG2細胞本身即可以表達和分泌IMD，與Guo等［11］的研究結果相吻合。

Wnt信號傳導通路在腫瘤細胞的增殖過程中起著非常重要的作用，經典Wnt信號通路的激活有賴于β?catenin在細胞質中異常蓄積而后入核，通過與T細胞因子/淋巴增強因子（T?cell factor/lymphoid en?hancing factor，TCF/LEF）形成轉錄因子復合體，調控下游靶基因如cyclin D1和c?myc的轉錄表達［12，13］。研究表明，30%～40%的肝癌發生Wnt通路的失調或β?catenin基因突變；62%～70%的肝癌出現胞質和胞核的β?catenin表達，在分化程度較差的肝癌細胞核內可以看到β?catenin的表達更明顯［14～16］。c?myc是第一個被發現的β?catenin/TCF復合物的下游靶基因，在細胞凋亡、增殖、代謝、DNA修復以及血管形成等各種生物學過程中發揮關鍵作用［17］；cyclin D1基因是β?catenin/TCF途徑的另一個直接靶基因，若持續高水平表達，可使細胞停留于細胞周期的S期，過度增殖進而發生惡性轉化［18］。我們的研究中，TOPFlash/FOPFlash熒光素酶檢測結果表明，IMD可增強β?catenin/TCF的轉錄活性；且Wnt下游靶基因cyclin D1和c?myc的轉錄表達明顯上調。提示IMD激活Wnt信號通路，進而促進HepG2細胞的增殖。

總之，本研究發現，作為CGRP超家族成員，IMD通過與受體結合，激活Wnt信號通路發揮其促肝癌細胞增殖作用，為肝癌的治療提出新的思路。IMD拮抗劑可能作為抗肝癌的治療手段之一。

［1］Takei Y，Inoue K，Ogoshi M，et al.Identification of novel adreno?medullin in mammals：a potent cardiovascular and renal regulator［J］.FEBS Lett，2004，556（1?3）：53-58.

［2］Morimoto R，Satoh F，Murakami O，et al.Expression of adrenomedul?lin 2/intermedin in human adrenal tumors and attached non?neoplas?tic adrenal tissues［J］.J Endocrinol，2008，198（1）：175-183.

［3］Hikosaka T，Tsuruda T，Nagata S，et al.Adrenomedullin production is increased in colorectal adenocarcinomas；its relation to matrix me?talloproteinase?9［J］.Peptides，2011，32（9）：1825-1831.

［4］Smith RS Jr，Gao L，Blesdsoe G，et al.Intermedin is a new angiogen?ic growth factor［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297（3）：H1040-H1047.

［5］Xu Y，Pang X，Dong M，et al.Nesfatin?1 inhibits ovarian epithelial carcinoma cell proliferation in vitro［J］.Biochem Biophys Res Com?mun，2013，440（4）：467-472.

［6］Zhang Y，Zhang S，Shang H，et al.Basic fibroblast growth factor up?regulates adrenomedullin expression in ovarian epithelial carcinoma cells via JNK?AP?1 pathway［J］.Regul Pept，2009，157（1?3）：44-50.

［7］Bell D，McDermott BJ.Intermedin（adrenomedullin?2）：a novel counter?regulatory peptide in the cardiovascular and renal systems［J］.Br J Pharmacol，2008，153 Suppl 1：S247-S262.

［8］Roh J，Chang CL，Bhalla A，et al.Intermedin is a calcitonin/calcito?nin gene?related peptide family peptide acting through the calcito?nin receptor?like receptor/receptor activity?modifying protein recep?tor complexes［J］.J Biol Chem，2004，279（8）：7264-7274.

［9］Billottet C，Janji B，Thiery JP，et al.Rapid tumor development and potent vascularization are independent events in carcinoma produc?ing FGF?1 or FGF?2［J］.Oncogene，2002，21（53）：8128-8139.

［10］Di Blasio AM，Cremonesi L，Vigano P，et al.Basic fibroblast growth factor and its receptor messenger ribonucleic acids are ex?pressed in human ovarian epithelial neoplasms［J］.Am J Obstet Gynecol，1993，169（6）：1517-1523.

［11］Guo X，Schmitz JC，Kenney BC，et al.Intermedin is overexpressed in hepatocellular carcinoma and regulates cell proliferation and survival［J］.Cancer Sci，2012，103（8）：1474-1480.

［12］Moon RT，Bowerman B，Boutros M，et al.The promise and perils of Wnt signaling through beta ?catenin［J］.Science，2002，296（5573）：1644-1646.

［13］Clevers H.Wnt/beta?catenin signaling in development and disease［J］.Cell，2006，127（3）：469-480.

［14］Wong CM，Fan ST，Ng IO.beta?Catenin mutation and overexpres?sion in hepatocellular carcinoma：clinicopathologic and prognostic significance［J］.Cancer，2001，92（1）：136-145.

［15］Devereux TR，Stern MC，Flake GP，et al.CTNNB1 mutations and beta?catenin protein accumulation in human hepatocellular carci?nomas associated with high exposure to aflatoxin B1［J］.Mol Car?cinog，2001，31（2）：68-73.

［16］Hsu HC，Jeng YM，Mao TL，et al.Beta?catenin mutations are asso?ciated with a subset of low?stage hepatocellular carcinoma negative for hepatitis B virus and with favorable prognosis［J］.Am J Pathol，2000，157（3）：763-770.

［17］Bienz M，Clevers H.Linking colorectal cancer to Wnt signaling［J］.Cell，2000，103（2）：311-320.

［18］Tetsu O，McCormick F.Beta?catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells［J］.Nature，1999，398（6726）：422-426.