Raf激酶抑制蛋白和上皮型鈣黏蛋白在結腸癌中的表達及臨床意義

張偉，高志安，王瑞玥

（1.遼寧醫(yī)學院病理學教研室，遼寧 錦州 121001；2.撫順礦務局總醫(yī)院病理科，遼寧 撫順 113008）

結腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，全球發(fā)病率和死亡率排在第三位和第五位［1］。近年來，隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，我國結腸癌的發(fā)病率逐年上升［2］。結腸癌的具體病因不清，并且早期癥狀不明顯，有效的早期預防和診斷比較困難。淋巴結轉(zhuǎn)移是結腸癌的主要轉(zhuǎn)移途徑，淋巴結轉(zhuǎn)移者預后較差，是致患者死亡的主要原因［3］。因此，研究結腸癌發(fā)生、發(fā)展機制，探討新的治療方案具有重要的臨床意義。Raf激酶抑制蛋白（Raf?1 ki?nase inhibitor protein，RKIP）是磷脂酞乙醇胺結合蛋白家族，多項研究顯示，RKIP在細胞生長、增殖、分化和腫瘤的發(fā)展等過程密切相關，在多種惡性腫瘤中表達減弱。RKIP蛋白是腫瘤研究領域新的熱點。上皮型鈣黏蛋白（E?cadherin）是一種轉(zhuǎn)移抑制因子，存在于上皮細胞中，對腫瘤細胞起到接觸抑制作用。本研究通過檢測結腸癌組織中RKIP蛋白和E?cadherin蛋白的表達，探討二者在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

取撫順礦務局總醫(yī)院2012年至2013年手術切除的62例結腸癌組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣10 cm以上）的存檔蠟塊。腫瘤組織經(jīng)病理檢查均為腺癌，全部患者術前均未行放化療。男36例，女26例；年齡31～76歲，平均年齡53歲，≥53歲者29例，＆lt;53歲者33例；高、中分化腺癌42例，低分化腺癌20例；Dukes分期：A+B期34例，C+D期28例；無淋巴結轉(zhuǎn)移40例，有淋巴結轉(zhuǎn)移22例。所有標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片。

1.2 試劑與方法

RKIP蛋白兔抗人多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，E?cadherin蛋白鼠抗人單克隆抗體，購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。采用免疫組織化學SP法對結腸癌組織中RKIP蛋白和E?cadherin蛋白進行檢測，用已知陽性的切片做陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 結果判定

E?cadherin蛋白在正常結腸組織中上皮細胞膜呈均勻致密表達，在結腸癌細胞的細胞膜或細胞質(zhì)呈彌漫或灶狀表達。判斷標準：腫瘤細胞陽性率＆lt;10%為陰性；腫瘤細胞陽性率＆gt;10%為陽性。RKIP蛋白按染色強度和陽性表達細胞數(shù)比例，參考Mathew［4］的分級標準：無表達，為陰性；著色瘤細胞＆lt;50%或染色較淺為（+）；著色瘤細胞＆gt;50%且染色較深為（++），（+）和（++）均為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗及Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 RKIP蛋白和E?cadherin蛋白在結腸癌組織和癌旁組織中的表達

RKIP蛋白在結腸癌組織中的表達陽性率80.6%，低于癌旁結腸組織的陽性表達率61.2%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.64，P＆lt;0.05）。E?cadherin蛋白在結腸癌組織中的表達陽性率為91.9%，低于癌旁結腸組織的陽性表達率59.7%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.58，P＆lt;0.05，圖1～4）。

2.2 RKIP蛋白和E?cadherin蛋白的表達與結腸癌臨床病理因素的關系

RKIP蛋白和E?cadherin蛋白的表達均與結腸癌患者的性別、年齡無明顯相關性（P＆gt;0.05）。RKIP蛋白的表達與淋巴結轉(zhuǎn)移有關，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。E?cadherin蛋白的表達與結腸癌的分化程度、Dukes分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關，差異均有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），結果見表1。

2.3 RKIP蛋白和E?cadherin蛋白在結腸癌組織中表達的相關性

Spearman等級相關分析顯示，RKIP蛋白和E?cadherin蛋白在結腸癌組織中的表達呈正相關（r＝ 0.13，P＆lt;0.05），結果見表2。

圖1 RKIP蛋白在癌旁黏膜的細胞質(zhì)高表達 免疫組化S P法 ×200Fig.1 High expression of RKIP protein in adjacent colon mucosalocated in the cytoplasm immumocytochemistry SPmethod ×200

圖2 RKIP蛋白在結腸癌中的細胞質(zhì)低表達 免疫組化S P法 ×200Fig.2 Low expression of RKIP protein in colon carcinoma locatedin the cytoplasm immumocytochemistry SP method ×200

圖3 E?cadherin蛋白在癌旁黏膜的細胞質(zhì)高表達 免疫組化S P法×100Fig.3 High expression of E?cadherin protein in adjacent colonmucosa located in the cytoplasm immumocytochemistrySP method ×100

圖4 E?cadherin蛋白在結腸癌中的細胞質(zhì)低表達 免疫組化S P法×200Fig.4 Low expression of E?cadherin protein in colon carcinomalocated in the cytoplasm immumocytochemistry SPmethod ×200

表1 結腸癌組織中RKIP蛋白和E?cadherin蛋白的表達與臨床病理因素的關系Tab.1 Expression of RKIP and E?cadherin proteins in colon carcinoma and relationship with clinicopathological factors

表2 RKIP蛋白和E?cadherin蛋白在結腸癌組織中表達的相關性Tab.2 Correlation of expression between RKIP and E?cadherin proteins

3 討論

細胞信號轉(zhuǎn)導過程發(fā)生障礙或異常，必然會導致細胞生長、增殖、分化、代謝、調(diào)亡等一系列生物學異常，從而引起各種疾病甚至腫瘤發(fā)生。RKIP是一種堿性胞漿蛋白，屬于磷脂酞乙醇胺結合蛋白家族。由Bemie等［5］于1984年從牛腦中分離成功，于1999年被Yeung等［6］命名。在生理狀態(tài)下，RKIP蛋白與心臟功能調(diào)節(jié)、髓鞘磷脂的組織形成和精子的發(fā)育相關。近期發(fā)現(xiàn)，RKIP蛋白與惡性腫瘤關系密切，成為腫瘤領域的研究熱點。在許多人類惡性腫瘤中，如肺癌、肝細胞癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、鼻咽癌中［7～12］，RKIP蛋白的表達明顯減少，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關。本研究結果顯示RKIP蛋白在癌旁黏膜組織和結腸癌組織中的陽性率依次降低，差異有統(tǒng)計學意（P＆lt;0.05），RKIP蛋白在有淋巴結轉(zhuǎn)移的結腸癌中比無淋巴轉(zhuǎn)移結腸癌中的表達明顯降低（P＆lt;0.05），RKIP蛋白在結腸癌中的表達與年齡、性別、分化程度、Dukes分期等因素無關。提示RKIP蛋白在結腸癌的發(fā)生和淋巴結轉(zhuǎn)移的機制中起到重要作用，其具體機制可能與抑制MAPK或NF?κB 信號傳導途徑有關［13，14］，RKIP蛋白在MAPK通路中，對Raf?1和MEK?1形成復合物起到抑制作用，使Raf?1和MEK?1分離，從而分別與raf?1和MEK?1結合抑制下游信號，抑制ERK的活性。RKIP蛋白可以作用于介導NF?κB抑制物磷酸化及去磷酸化激酶復合物的上游，來減少NF?κB基底水平的轉(zhuǎn)錄，抑制NF?κB激活。RKIP蛋白亦可以通過NF?κB上游的調(diào)節(jié)因子如NF?κB誘導激酶、TGF?β1從而抑制NF?κB的活化［15］。

惡性腫瘤最重要生物學行為是其對鄰近正常組織的侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與黏附分子密切相關。E?cadherin屬于鈣離子依賴性黏附蛋白家族，是一種主要介導同質(zhì)細胞間連接的黏附蛋白，主要分布于上皮組織中，對維持上皮細胞形態(tài)和結構的完整性起到重要作用。本研究結果顯示E?cadherin蛋白在結腸癌組織中的陽性表達與分化程度、Dukes分期、淋巴結轉(zhuǎn)移相關（P＆lt;0.05），與Xing等［16］的研究結果一致。提示在結腸癌組織中，當E?cadherin蛋白表達下降時，細胞間黏附能力下降，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。可能的機制為：E?cadherin蛋白的表達下降，使腫瘤細胞間喪失接觸抑制，導致腫瘤細胞無限增殖，失去分化；E?cadherin蛋白的表達下降，使其不能與細胞漿內(nèi)的Catenin形成完整的E?cadherin/Catenin復合物，無法固定到細胞骨架上，與相鄰細胞形成穩(wěn)定的連接，導致細胞間連接松散，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移；E?cad?herin蛋白表達下降，促進細胞內(nèi)可形成β?catenin?LEF復合物，使間質(zhì)細胞發(fā)生特異性轉(zhuǎn)錄，細胞發(fā)生上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），細胞黏附能力下降，侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強。

RKIP蛋白和E?cadherin蛋白表達的降低可能與結腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關。有文獻報道可能的機制如下：（1）通過干擾MAPK信號通路。Shin等［17］指出RKIP蛋白可能通過干擾Raf?1/MEK/ERK信號通路的傳導，抑制ERR通路和MEK磷酸化，促進Snail對E?cadherin蛋白的抑制，促進E?cadherin蛋白與β?Catenin形成復合物，減少游離E?cadherin蛋白，使E?cadherin蛋白表達降低。（2）通過影響TGF?β信號通路。Janda等［18］提出Raf和TGF?β信號通路的協(xié)同作用使E?cadherin蛋白表達下調(diào)，是EMT的早期事件。RKIP蛋白可能通過抑制Raf?1、影響TGF?β信號傳導通路，對E?cadherin蛋白的表達進行調(diào)控，使E?cadherin蛋白表達降低。具體機制有待于進一步研究。

結腸癌中聯(lián)合檢測RKIP蛋白和E?cadherin蛋白的表達水平，可能為尋找結腸癌新的診斷標志物和靶向治療提供理論及實驗依據(jù)。

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