兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血糖血脂的影響

蘭 怡，盧 偉，李琳琳，王 燁，龍 梅，毛新民（.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 80054；. 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 80054；.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 80054）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由于胰島素相對或絕對缺乏以及不同程度的胰島素抵抗引起的物質(zhì)代謝紊亂綜合征[1]，其基本生理特征為持續(xù)高血糖，會誘發(fā)一系列微血管及大血管病變等嚴重的并發(fā)癥[2]。臨床常見的口服降糖藥物在控制血糖的同時會引起一些副作用，中藥因其多成分、多途徑、多靶點等特點，在糖尿病及并發(fā)癥的防治方面具有獨特優(yōu)勢[3]。兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）又稱昆侖雪菊，為菊科金雞菊屬一年生草本植物，分布在我國新疆昆侖山區(qū)，野生資源豐富[4]。研究發(fā)現(xiàn)兩色金雞菊在體外具有很強的清除自由基能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性作用[5-6]；可增加高血壓小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）的活力，同時降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量[7]；兩色金雞菊乙酸乙酯萃取物、水提物和活性成分馬里苷具有細胞保護作用，能對抗β細胞損傷[8]；兩色金雞菊水提物可明顯改善大鼠腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）所致的糖耐量受損情況[9]等。本實驗采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)、腹腔注射小劑量STZ建立實驗性糖尿病模型大鼠，觀察兩色金雞菊醇提物對糖尿病大鼠血糖血脂的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 兩色金雞菊提取物 兩色金雞菊（新疆雪菊生物科技公司，批號20130301）按本課題組已申報的專利工藝（專利號：CN 201210270799）進行提取，并冷凍干燥制備成兩色金雞菊提取物。

1.1.2 實驗動物及飼料 雄性SD大鼠，體質(zhì)量180 ~220 g，SPF級，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（新）2011-0004；飼養(yǎng)環(huán)境：光照12 h·d-1，溫度（21 ± 2） ℃，濕度40% ~ 45%。高糖高脂飼料：2.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉、20.0%蔗糖、10.0%豬油、67.0%基礎飼料（江蘇省協(xié)同生物工程有限責任公司，批號130520）。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，規(guī)格：1 g，批號201305）；二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：0.5 g，批號201207）；糖化血紅蛋白（HbAlc）試劑盒（上海研輝生物科技有限公司，批號20111101A）；膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HLD-C）測試盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號141713001）。

ACCU-CHEK Performa羅氏卓越型血糖儀[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]；TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；XP205電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ACS-1.5A電子稱（上海友聲衡器有限公司）；Mindray BS-120全自動生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立 雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)3 d后按體質(zhì)量均衡隨機分為高脂高糖飼料組和正常對照組。飼養(yǎng)6周后，禁食12 h，大鼠一次性腹腔注射1%的STZ溶液（溶劑為pH 4.5的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液），劑量為30 mg·kg-1。正常組給予相同體積的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液。注射STZ溶液2周后，禁食12 h，尾尖取血測定大鼠空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥11.1 mmol·L-1視為造模成功[10]。

1.2.2 分組及干預 將造模成功的大鼠隨機分為5組：模型組、二甲雙胍（0.2 g·kg-1）組、兩色金雞菊醇提物低（0.4 g·kg-1）、中（0.8 g·kg-1）、高（1.6 g·kg-1）劑量組。每天灌胃給藥1次（ 模型組和正常對照組給予等量蒸餾水），灌胃容積為10 mL·kg-1。除正常對照組外，其余5組繼續(xù)喂食高糖、高脂飼料，連續(xù)灌胃給藥4周，每周測量1次FBG。

1.2.3 處理方法及觀察指標 藥物干預4周后，禁食12 h，給予2.5%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心（15 min，4 ℃，3000 r·min-1），分離血清，– 80 ℃保存；同時取適量腹主動脈血，采用糖化血紅蛋白測試儀測定全血中HbAlc的含量。分離肝臟，稱重并計算肝臟系數(shù)。采用全自動生化儀測量各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST和ALT含量。采用放射免疫法測量各組大鼠血清胰島素（Ins）含量（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科檢測）。HbAlc是指與葡萄糖結合的血紅蛋白占全部血紅蛋白的比例。采用公式胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，IRI） = FBG×空腹胰島素/22.5計算IRI，評價胰島素抵抗情況；采用公式胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI） = – ln（FBG×空腹胰島素）計算ISI，考察兩色金雞菊改善胰島素敏感性的情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠FBG曲線下面積和HbAlc含量的影響

將4周的FBG值繪制成曲線，計算曲線下面積（AUC）。糖尿病大鼠FBG-AUC結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠FBG-AUC明顯升高（P <0.01）；干預4周后，陽性藥二甲雙胍組下降幅度最大，與模型組相比有顯著統(tǒng)計學差異（P < 0.01）；兩色金雞菊醇提物中、高劑量組也可顯著降低FBGAUC（P < 0.05），其中高劑量組作用與二甲雙胍組作用相近，兩組數(shù)值無統(tǒng)計學差異，見表1。

HbAlc測量結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠HbAlc含量明顯增高（P < 0.01）；藥物干預4周后，二甲雙胍、醇提物三個劑量組均可顯著降低大鼠血中HbAlc含量，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。詳見表1。

表1 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠FBG-AUC和HbAlc含量的影響. x± sTab 1 Effect of the alcohol extract from Coreopsis tinctoria Nutt. on FBG-AUC and HbAlc in diabetic rats. x± s

2.2 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血清Ins、IRI和ISI的影響

實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清Ins含量明顯增加（P < 0.01）；干預4周后，與模型組相比，二甲雙胍組和兩色金雞菊醇提物三個劑量組大鼠血清Ins含量明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P <0.01）。IRI和ISI計算結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠IRI明顯升高（P < 0.01）、ISI明顯降低（P <0.01）；藥物干預4周后，各給藥組大鼠胰島素抵抗癥狀都得到緩解，兩色金雞菊醇提物三個劑量組和二甲雙胍組大鼠IRI明顯下降、ISI顯著增加，與模型組相比均具有顯著統(tǒng)計學差異（P < 0.05），兩色金雞菊醇提物高劑量組的效果最明顯，優(yōu)于陽性藥二甲雙胍。詳見表2。

2.3 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠肝臟指數(shù)、AST和ALT含量的影響

實驗性糖尿病模型大鼠肝臟指數(shù)明顯高于正常對照組（P < 0.01）；干預4周后，與模型組比較各給藥組大鼠肝臟指數(shù)均明顯降低（P < 0.01）。與正常對照組相比，模型組大鼠血清中AST和ALT的含量明顯增高，具有顯著統(tǒng)計學差異（P < 0.01）。藥物干預4周后，與模型組相比，兩色金雞菊醇提物三個劑量組可顯著降低AST和ALT數(shù)值（P < 0.01）；陽性藥二甲雙胍組大鼠血漿中AST和ALT含量也明顯降低（P <0.05）。詳見表3。

2.4 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血脂四項的影響

實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C的含量明顯增加（P < 0.01）；干預4周后，與模型組相比，兩色金雞菊醇提物各劑量組可明顯降低糖尿病大鼠血清中TC、TG、LDL-C的含量，與陽性藥二甲雙胍組效果相當。藥物干預4周后，與模型組相比，二甲雙胍組大鼠血清中HDL-C的含量有增加趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P > 0.05）；兩色金雞菊醇提物各劑量組均能增加HDL-C的含量，且均有顯著統(tǒng)計學差異（P < 0.01）。 詳見表4。

表2 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血清Ins、IRI和ISI的影響.±sTab 2 Effect of the alcohol extract from Coreopsis tinctoria Nutt. on Ins, IRI and ISI in diabetic rats.±s

表2 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血清Ins、IRI和ISI的影響.±sTab 2 Effect of the alcohol extract from Coreopsis tinctoria Nutt. on Ins, IRI and ISI in diabetic rats.±s

注：與正常對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組相比，#P <0.05，##P < 0.01Note: compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01; compared with model group, #P < 0.05, ##P < 0.01

組別 例數(shù) 給藥劑量/g·kg-1Ins/μIU·mL-1 IRI ISI正常對照組10 – 23.8±6.3 4.9±1.5 – 4.7±0.3模型組 7 – 45.5±18.4** 50.3±20.8** – 6.9±0.4**二甲雙胍組8 0.2 27.3±3.8## 19.2±4.0## – 6.1±0.2##11 0.4 29.7±17.3## 31.3±17.4## – 6.4±0.5#醇提物中劑量組醇提物低劑量組11 0.8 23.1±8.4## 19.4±6.8## – 6.0±0.4##醇提物高劑量組12 1.6 19.1±5.2## 15.7±6.3## – 5.8±0.4##

表3 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠肝臟指數(shù)、AST和ALT的影響.± sxTab 3 Effect of the alcohol extract from Coreopsis tinctoria Nutt. on liver index, AST and ALT in diabetic rats.±s

注：與正常對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組相比，#P <0.05，##P < 0.01Note: compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01; compared with model group, #P < 0.05, ##P < 0.01

組別 例數(shù)給藥劑量/g·kg-1肝臟指數(shù)/×10-2 AST/IU·L-1 ALT/IU·L-1 10 – 1.955±0.142 107.8±15.0 48.5±14.5模型組 7 – 6.066±1.270** 389.0±197.1** 317.1±169.8**二甲雙胍組正常對照組8 0.2 4.685±0.371## 279.8±109.4#162.7±93.3##醇提物低劑量組11 0.4 4.784±0.332##185.6±38.8## 127.2±24.7##醇提物中劑量組11 0.8 4.661±0.333##170.0±46.4##117.0±17.7##醇提物高劑量組12 1.6 4.988±0.573##225.6±72.6##148.6±58.3##

3 討論

兩色金雞菊主要分布于新疆和田地區(qū)海拔3000米左右的昆侖山區(qū)，有較豐富的野生資源[4]。長期以來，兩色金雞菊被當?shù)鼐用癞敾ú栾嬘茫陡省⑿云剑瑲w肝、大腸二經(jīng)，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效，用花泡茶飲，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒，是具有廣闊前景和研究價值的新品種[11]。

表4 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血脂四項的影響.x± sTab 4 Effect of the alcohol extract from Coreopsis tinctoria Nutt. on blood lipids in diabetic rats. ±s

表4 兩色金雞菊醇提物對實驗性糖尿病大鼠血脂四項的影響.x± sTab 4 Effect of the alcohol extract from Coreopsis tinctoria Nutt. on blood lipids in diabetic rats. ±s

注：與正常對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01Note: compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01; compared with model group, #P < 0.05, ##P < 0.01

組別 例數(shù) 給藥劑量 /g·kg-1 TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 HDL-C/mmol·L-1 LDL-C/mmol·L-1正常對照組 10 – 1.2±0.2 0.5±0.1 0.8±0.1 0.4±0.1模型組 7 – 12.2±9.1** 2.7±1.4** 1.0±0.4 13.1±9.5**二甲雙胍組 8 0.2 3.9±1.5## 1.0±0.5## 1.1±0.2 1.8±0.8##醇提物低劑量組 11 0.4 6.0±1.9## 1.1±0.4## 2.1±0.6## 2.8±1.9##醇提物中劑量組 11 0.8 5.5±2.6## 0.9±0.4## 1.7±0.1## 2.0±1.3##醇提物高劑量組 12 1.6 5.3±2.0## 0.6±0.3## 1.6±0.4## 1.8±0.8##

本實驗采用經(jīng)典的高糖、高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量STZ的方法建立實驗性糖尿病大鼠模型。實驗結果顯示，模型大鼠出現(xiàn)明顯的“三多一少”、毛發(fā)干枯雜亂、倦臥以及活動減少癥狀；FBG-AUC、TC、TG、LDL-C、HbAlc、Ins水平和IRI明顯高于正常對照組（P < 0.01），ISI明顯下降（P < 0.01）。以上結果說明，采用該方法建立的實驗性糖尿病模型大鼠出現(xiàn)明顯高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗和脂代謝紊亂等癥狀。藥物干預4周后，醇提物三個劑量組能夠不同程度的降低FBG-AUC，降低HbA1c和Ins含量，增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗。以上實驗結果顯示，兩色金雞菊醇提物能夠改善實驗性糖尿病大鼠糖代謝紊亂的情況。

研究[12]發(fā)現(xiàn)78.5l%的T2DM患者伴有血脂異常情況，表現(xiàn)為TG、TC、LDL-C和極低脂密度脂蛋白水平升高，HDL-C水平下降，其中TG顯著升高是T2DM中最常見的脂質(zhì)代謝紊亂的表現(xiàn)。高水平的TG分解產(chǎn)生大量游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA），后者干擾胰島素在外周組織中與受體的結合，使外周組織對胰島素的敏感性下降[13]；機體內(nèi)TG含量增加，多伴有超重或肥胖，導致脂肪細胞肥大和增生，增大的脂肪細胞可分泌一系列激素和細胞因子，促進胰島素抵抗（IR）發(fā)生。本研究中，給予兩色金雞菊醇提物干預后，除對血糖有一定改善作用外，各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C的含量都得到了顯著降低（P <0.01），且HDL-C的含量顯著升高（P < 0.01），表現(xiàn)出在血脂異常方面具有很好的改善作用，這可能與改善胰島素抵抗有關。

此外，兩色金雞菊醇提物還可降低實驗性糖尿病大鼠的肝臟指數(shù)，說明兩色金雞菊醇提物可以抑制糖尿病大鼠肝臟的肥大現(xiàn)象。對于肝臟功能指標考察發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊醇提物可以顯著降低模型大鼠AST和ALT的含量。綜上，兩色金雞菊醇提物可改善實驗性糖尿病大鼠血糖、血脂紊亂情況，改善胰島素抵抗狀態(tài)，保護肝臟等，但其具體的藥效物質(zhì)基礎和作用機制尚不清楚，因此還需進一步的研究，旨在為兩色金雞菊功能食品和藥品的開發(fā)提供參考。