HPLC-MS/MS法測定全血中他克莫司的濃度

趙冠人，申 健，彭明麗，蔣 南（.解放軍309醫院藥劑科，北京 0009；.河北北方學院，河北 張家口 075000）

他克莫司（tacrolimus，FK506）是從鏈霉菌的代謝物中分離得到的一種大環內酯類免疫抑制劑，臨床上廣泛用于預防和治療器官移植后的排異反應，其藥效強度是環孢素的50 ~ 100倍[1]。但他克莫司不良反應明顯、治療窗窄、生物利用度低，在藥動學和藥效學上存在明顯的個體差異[2]，給臨床治療增加了難度，因此在實際應用中需進行治療藥物監測。

目前常用的他克莫司血藥濃度監測方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA）[3]、微粒子酶免疫分析法（MEIA）[4]、高效液相色譜法（HPLC）[5]、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）法[6]等。其中，ELISA法和MEIA法對他克莫司的體內代謝產物產生免疫交叉反應，測定結果比實際值高；HPLC法的靈敏度無法完全滿足體內他克莫司的測定范圍；HPLCMS/MS法靈敏度高，且只測定原型藥物，能更準確地表達體內他克莫司的含量，可廣泛用于治療藥物監測。本研究以地西泮為內標，旨在建立簡便、快速、靈敏的HPLC-MS/MS法測定人全血中他克莫司的濃度。

1 儀器與試藥

API3200型三重四級桿串聯質譜儀，配有離子噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.4.1數據處理軟件（美國Applied Biosystem公司）；Prominence LC-20A超快速高效液相色譜系統，包括CBM-20A系統控制器，LC-20AD二元輸液泵，DGU-20A3脫氣裝置，SIL-20AHT自動進樣器（日本Shimadzu公司）；VDRTEX-5型旋渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；5420型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；MG-2200型氮氣吹干儀（東京理化器械株式會社）。

他克莫司（杭州中美華東制藥有限公司，純度：99%，批號20120604）；地西泮（中國藥品生物制品檢定所，批號171225）；甲醇、乙腈和醋酸銨均為色譜純，硫酸鋅為分析純，水為Milli-Q制備超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm（25 ℃）；空白全血樣品由解放軍第309醫院輸血科提供，患者血液樣品由解放軍第309醫院器官移植中心提供。

2 方法與結果

2.1 HPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 質譜條件 離子源：離子噴霧離子化源（ion spray）；離子噴射電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：450 ℃；源內氣體1（GS1，N2）：20 psi；源內氣體2（GS2，N2）：60 psi；氣簾氣體壓力（Cur Gas）：30 psi。正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測（MRM）；DP：67；EP：67；CE：36；CXP：7；用于定量分析的離子反應分別為m/z 821.6→768.5（他克莫司）和m/z 285.1→193.1（地西泮）。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 SBC18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為乙腈溶液，B為含有0.01 mol·L-1醋酸銨與0.5%甲酸的水溶液，采用梯度洗脫，0.01 ~ 0.50 min，A-B（65∶35）→（95∶5），0.51 ~ 2.40 min，A-B（95∶5）；2.41 ~ 5.00 min，A-B（65∶35）；流速0.7 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液與內標溶液的配制 精密稱取他克莫司對照品適量，加乙腈溶解，定量配制成14.89、29.78、59.56、119.12、238.24、297.79 μg·mL-1標準儲備液。精密稱取地西泮適量，加乙腈溶解，定量配制成32.37 ng·mL-1的內標溶液，上述溶液置于6 ℃冰箱儲存。

2.2.2 硫酸鋅溶液的制備 精密稱取硫酸鋅七水合物適量，加純化水溶解，配制成0.02 mol·L-1硫酸鋅溶液。

2.3 全血樣品的處理

取全血樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入內標溶液10 μL，混勻，加入硫酸鋅溶液100 μL，渦旋混合0.5 min，加入甲醇800 μL，渦旋混合1 min，14 000 r·min-1離心12 min，取上清液于50 ℃下用氮氣吹干，殘渣用甲醇100 μL溶解，渦旋混合1 min，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 μL進樣分析。

2.4 質譜分析

采取正離子方式檢測，將他克莫司溶于流動相中，按“2.1.1”項下操作，于二級全掃描質譜圖中獲得他克莫司準分子離子峰[M+H]+m/z 821.6，選擇該準分子離子峰進行碰撞誘導電離，生成主要的碎片離子峰m/z 768.5用于定量。

2.5 方法專屬性考察

分別取空白全血、加入適量他克莫司標準溶液和內標溶液的全血樣品，按“2.3”項下方法處理，另取他克莫司和內標的對照品溶液，依“2.1.2”項下方法進樣分析，詳見圖1。由圖1可知，他克莫司的保留時間約為2.4 min，內標地西泮的保留時間約為1.8 min，內源性物質對測定無干擾，表明本方法具有較高的特異性。

圖1 他克莫司和內標地西泮的色譜圖A – 空白全血樣品，B – 他克莫司和內標，C – 他克莫司和內標的全血樣品；1 – 內標（地西泮），2 – 他克莫司Fig 1 Chromatograms of tacrolimus and diazepamA – blank whole blood, B – tacrolimus and internal standard, C – blank whole blood with tacrolimus and internal standard; 1 – internal standard(diazepam), 2 – tacrolimus

2.6 線性關系考察

平行吸取6份空白全血90 μL，分別加入10 μL他克莫司標準系列溶液和10 μL內標溶液，配制成相當于全血濃度為1.49、2.98、5.96、11.91、23.82、29.78 ng·mL-1的全血樣品，按“2.3”項下方法處理后，依照“2.1.2”項下條件進樣測定，以樣品與內標峰面積比值（Y）對濃度（C）進行回歸計算，得回歸方程：Y = 4.80 C +2.62×10-3（r = 0.999 2），他克莫司在1.49 ~ 29.78 ng·mL-1范圍內線性關系良好，最低檢測限為0.50 ng·mL-1。

2.7 基質效應

精密吸取空白全血100 μL于1.5 mL離心管中，不加內標，按“2.3”項下操作，向獲得的上清液中分別精密加入他克莫司標準溶液和內標溶液，配制低、中、高三個濃度（分別為2.98、11.91、29.78 ng·mL-1），取5 μL進樣分析，測定他克莫司色譜峰面積，求出與對照品溶液測得峰面積的比值為基質效應，結果表明基質效應均在85% ~ 115%范圍內。

2.8 準確度與精密度

分別于90 μL的空白全血中加入低、中、高3種濃度的他克莫司對照品溶液10 μL，混勻，得低、中、高3種不同濃度他克莫司的全血樣品，按“2.3”項下方法處理，依法測定批內與批間的準確度與精密度（3 d），詳見表1。

表1 他克莫司的準確度與精密度. n = 6Tab 1 Precision and accuracy of tacrolimus. n = 6

2.9 提取回收率

配制他克莫司低、中、高濃度（2.98、11.91、29.78 ng·mL-1）全血樣品各3份，按“2.3”項下操作后依法進樣，記錄峰面積。另取經過預處理的全血空白基質，分別加入3個相應濃度的對照品溶液進行分析。以每一濃度兩種處理方法得到的峰面積比值計算提取回收率。結果表明，他克莫司各濃度提取回收率均在85% ~ 115%范圍內。

2.1 0 穩定性考察

分別取他克莫司低、中、高濃度（2.98、11.91、29.78 ng·mL-1）質控樣本，按“2.3”項下方法處理后，每一濃度進行3個樣本分析，考察全血樣本室溫放置24 h、經過3次凍融后他克莫司的穩定性，測得濃度與0時刻比較，變化率均小于15%，表明在上述儲存條件下樣品較穩定。

2.1 1 臨床應用

測定我院24例腎移植患者谷濃度血樣（晨起給藥前靜脈血），按照“2.3”項下方法操作，取上清液5 μL依法進樣，記錄FK506峰面積，根據內標法計算FK506濃度，濃度范圍為4.21 ~ 12.86 ng·mL-1，濃度均值為（8.14 ± 2.62） ng·mL-1。

3 討論

本研究建立HPLC-MS/MS法測定全血中他克莫司濃度的方法，較以往檢測方法有如下改進：1）線性范圍方面，王立明等[7]研究發現全血FK506的理想治療窗濃度范圍應為：術后第1個月內為11 ~ 15 ng·mL-1，第2 ~ 3個月為8 ~ 11 ng·mL-1，第3個月以后為5 ~ 8 ng·mL-1，本實驗建立測定方法在1.49 ~ 29.78 ng·mL-1范圍內線性關系良好，可完全滿足他克莫司日常治療藥物監測需求。2）全血樣本前處理方面，他克莫司在全血中大部分與紅細胞結合，少量與脂蛋白結合，故測定他克莫司血藥濃度需使用全血，且須充分沉淀蛋白以使其轉化成游離狀態，再加入破紅細胞劑硫酸鋅，便于提取完全。文獻[8]報道有乙醚萃取法，操作較為復雜，也有用3倍量乙腈沉淀蛋白[9-10]的報道，但沉淀比例不夠充分，本實驗采用8倍量甲醇沉淀蛋白，氮氣吹至殘渣后用甲醇溶解離心，可起到二次沉淀的作用，此方法在保證蛋白沉淀完全的同時起到增加方法靈敏度的效果。3）流動相優化方面，文獻[8-9]報道水相一般為不同比例的醋酸銨溶液，本實驗前期研究發現，水相中添加醋酸銨可有效改善他克莫司的峰形，但與其濃度高低的相關性不大；然而，流動相的酸度高低可對其峰形產生顯著影響。通過在水相中添加0.1%、0.2%、0.5%甲酸用以優化他克莫司峰形，結果表明0.01 mol·L-1醋酸銨與0.5%的甲酸溶液作為水相的條件下分離效果較好，故采用之。4）內標選擇方面，文獻[6-8]報道多用子囊霉素、環孢素D為內標，本實驗采用地西泮作為內標，地西泮的質譜檢測條件和極性與他克莫司相似，且價格較為低廉，可使他克莫司血藥濃度的日常測定更加經濟、實用。