醒神開郁方抗抑郁作用的實驗研究

王 巍，王曉華（.解放軍455醫院藥劑科，上海 0005；.解放軍0醫院藥劑科，遼寧 沈陽 0003）

抑郁癥是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙或情感性障礙，是一種以抑郁心境自我體驗為中心的臨床癥狀群或狀態[1]。抑郁癥嚴重困擾患者的生活和工作，給家庭和社會帶來沉重的負擔，約15%的抑郁癥患者死于自殺，美國每年因抑郁癥造成的經濟損失高達437億美元[2]。據國際衛生組織預測2020年抑郁障礙將成為全球第二位威脅人類健康、增加經濟負擔的疾患[2]。目前抗抑郁藥多以西藥為主，存在藥物副作用多，療效緩慢，且易復發，并有較強依賴性等問題[3-4]。因此，開發更加安全、高效、依賴性小的抗抑郁藥物已成為當前研究的一個熱點。醒神開郁方由石菖蒲、郁金、人參、當歸、炒棗仁、山茱萸、 五味子、川芎、丹參、靈芝組成，全方具有醒腦開郁、扶正固本之功效。本研究以小鼠懸尾和強迫游泳實驗、自主活動實驗、利血平誘導小鼠體溫下降實驗為基礎，探討醒神開郁方的抗抑郁作用，為其開發為藥品及臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

ICR小鼠，清潔級，雄性，體質量18 ~ 20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。動物飼養于第二軍醫大學實驗動物中心，動物實驗室許可證號：SYXK（滬）2012-0003；在相對溫度22 ~ 24 ℃、相對濕度40% ~70%的實驗室內飼養，光照時間隨自然變化，供給常規顆粒飼料和過濾水，自由飲食飲水。

1.2 實驗藥物

醒神開郁方制備：將組方中的各藥材洗凈、搗碎，浸泡過夜，按料液比1∶8加水，煮沸后再加熱1 h，重復上述過程兩次，過濾藥渣；合并兩次藥液并蒸干后干燥保存備用。制得醒神開郁方干粉得率為12.84%。所用原藥材均購于上海雷允上藥店。

鹽酸氟西汀膠囊（禮來蘇州制藥有限公司，規格：20 mg，批號2072A）；鹽酸氯米帕明片（上海信誼九福藥業有限公司，規格：25 mg，批號120613）；利血平注射液（廣東邦民制藥廠有限公司，規格：1 mg/mL，批號090512）。

1.3 試劑及儀器

去甲腎上腺素（NE）（批號088K1147）、5-羥色胺（5-HT）（批號0001431934）、多巴胺（DA）（批號BCBC7614V）均為Sigma公司產品。

JD-2型電子秒表（上海金雀表業有限公司）；CP225D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；T15SL型電子體溫計（廣州市健奧科技有限公司）；TDL-80-2B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀（濟南益延科技發展有限公司）；新芝DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；F-4500熒光分光光度計（日立公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

ICR小鼠隨機分為5組，每組10只。分別為空白對照組（因受試藥物均用0.5% CMC-Na溶液溶解，因此空白對照組給予0.5% CMC-Na溶液），醒神開郁方低劑量（1.50 g·kg-1）、中劑量（3.00 g·kg-1）、高劑量（6.00 g·kg-1）組和陽性藥物組。陽性藥物組：小鼠懸尾、強迫游泳實驗以及自主活動實驗給予鹽酸氟西汀膠囊（10 mg·kg-1）；利血平拮抗實驗給予鹽酸氯米帕明片（30 mg·kg-1）。每天灌胃一次，灌胃量0.02 mL·g-1，連續給藥7 d。

2.2 小鼠自主活動實驗[5]

末次給藥后1 h，將小鼠放入YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀內，適應3 min后，測定5 min內小鼠的自主活動次數。

2.3 小鼠懸尾實驗[6]

末次給藥后1 h，用膠帶將小鼠尾在距尾尖2 cm處粘在一水平支撐物上，使動物成倒掛狀態，支撐物放置于一敞口箱內，使小鼠頭部離底面約5 cm。小鼠懸掛6 min，記錄后4 min內累計不動時間。

2.4 小鼠強迫游泳實驗[7-8]

末次給藥后1 h，將小鼠單獨置于高20 cm、直徑14 cm的圓柱形玻璃缸中，缸內水深10 cm，水溫23 ~25 ℃。放入小鼠使其游泳6 min，記錄后4 min內累計不動時間。

2.5 利血平拮抗實驗[9-10]

該實驗中增加設置正常對照組小鼠10只；空白對照組給予0.5% CMC-Na溶液。各組動物末次給藥前1 h用電子溫度計插入小鼠肛門內約1.5 ~ 2 cm處測定肛溫，作為正常體溫值。除正常對照組外，其他各組測體溫后腹腔注射利血平注射液4 mg·kg-1（0.2 mg·mL-1，0.02 mL·g-1體質量）。觀察指標：1）灌胃給藥4 h后，再次測定各組動物的肛溫，記錄前后體溫變化的差異。2）觀察1 h后15 s內小鼠眼瞼下垂的情況。按Rubin分級標準，判斷下垂度。0度：正常開目；1度：眼瞼下垂1/4；2度：眼瞼下垂1/2；3度：眼瞼下垂3/4；4度：眼瞼完全閉合。3）小鼠腦內單胺遞質含量測定。給藥后禁食不禁水，24 h后處死小鼠，迅速斷頭取出大腦，冰浴中勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取上清液，熒光法測定單胺類神經遞質NE、5-HT以及DA的含量。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 對小鼠自主活動和不動時間的影響

由表1結果可知，醒神開郁方低、中、高劑量組小鼠自主活動數與空白對照組比較均無顯著性變化（P >0.05），表明醒神開郁方對小鼠自主活動無顯著影響。與空白對照組比較，陽性藥鹽酸氟西汀組能夠顯著縮短小鼠懸尾和強迫游泳不動時間（P < 0.01）。醒神開郁方低劑量組較空白對照組能縮短小鼠懸尾和強迫游泳不動時間（P < 0.05）；醒神開郁方中、高劑量組較空白對照組均能縮短小鼠懸尾和強迫游泳不動時間，具有顯著性差異（P < 0.01）。實驗結果表明醒神開郁方具有抗抑郁作用。

表1 醒神開郁方對小鼠自主活動和不動時間的影響. n = 10，±sTab 1 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the spontaneous motor activity and the immobility duration in mice. n = 10，±s

表1 醒神開郁方對小鼠自主活動和不動時間的影響. n = 10，±sTab 1 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the spontaneous motor activity and the immobility duration in mice. n = 10，±s

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01

組別 劑量/g·kg-1自主活動計數/次懸尾不動時間/s強迫游泳不動時間/s空白對照組 – 202.1±19.8 113.6±29.6 98.3±22.8鹽酸氟西汀組 0.01 204.2±23.4 64.6±22.2** 41.1±12.9**醒神開郁方低劑量組1.50 189.3±17.1 82.9±20.3* 70.4±22.4*醒神開郁方中劑量組3.00 201.8±19.0 75.6±17.7** 67.5±12.8**醒神開郁方高劑量組6.00 192.5±18.9 68.7±18.8** 58.1±23.3**

3.2 對利血平所致小鼠體溫下降和眼瞼下垂的影響

小鼠注射利血平后，出現了明顯的上瞼下垂、體溫下降等癥狀，空白對照組與正常對照組比較差異非常顯著（P < 0.01）。醒神開郁方中、高劑量組較空白對照組顯著抑制利血平所致小鼠體溫的下降（P <0.05，P < 0.01）；與空白對照組比較，醒神開郁方低、中、高劑量組顯著拮抗利血平所致小鼠眼瞼下垂作用（P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01）。結果見表2。

表2 醒神開郁方對利血平所致小鼠體溫下降和眼瞼下垂的影響.n = 10，±sTab 2 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the ptosis and hypothermia induced by reserpine in mice. n = 10，±s

表2 醒神開郁方對利血平所致小鼠體溫下降和眼瞼下垂的影響.n = 10，±sTab 2 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the ptosis and hypothermia induced by reserpine in mice. n = 10，±s

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與正常對照組比較，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with normal control group, ΔP < 0.05, ΔΔP <0.01

組別 劑量/g·kg-1 肛溫下降變化/℃眼瞼下垂程度/度正常對照組 – 0.5±0.3 0空白對照組 – 3.0±0.7ΔΔ 3.3±0.9Δ Δ鹽酸氯米帕明組 0.03 1.0±0.4** 1.3±0.9**醒神開郁方低劑量組 1.50 2.4±0.7 2.1±1.2*醒神開郁方中劑量組 3.00 2.1±0.6* 1.9±1.1*醒神開郁方高劑量組 6.00 1.5±0.6** 1.6±1.0**

3.3 對腦內單胺類神經遞質的影響

實驗結果顯示，空白對照組小鼠腦組織內單胺類神經遞質NE、5-HT、DA含量減少，與正常對照組比較均有顯著性差異（P < 0.01）。與空白對照組比較，醒神開郁方低劑量組能夠顯著升高小鼠腦組織內NE和5-HT含量（P < 0.01），對小鼠腦組織內DA含量也有升高，但無統計學差異。與空白對照組比較，醒神開郁方中、高劑量組均顯著升高小鼠腦組織內NE和5-HT含量（P < 0.01）；醒神開郁方中、高劑量組小鼠腦組織內DA含量較空白對照組的升高具有顯著性差異（P < 0.05，P < 0.01）。詳見表3。

表3 醒神開郁方對小鼠腦內單胺類神經遞質的影響. n = 10，±sTab 3 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the levels of monoamine neurotransmitter in brain of mice. n = 10，±s

表3 醒神開郁方對小鼠腦內單胺類神經遞質的影響. n = 10，±sTab 3 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the levels of monoamine neurotransmitter in brain of mice. n = 10，±s

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與正常對照組比較，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with normal control group, ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01

組別 劑量/g·kg-1 NE/ng·g-1 5-HT/ng·g-1 DA/ng·g-1正常對照組 – 613.2±72.0 494.8±38.9 821.8±112.2空白對照組 – 303.8±48.8ΔΔ 262.9±38.2ΔΔ 399.2±61.1ΔΔ鹽酸氯米帕明組0.03 493.3±62.0** 364.8±47.6** 589.2±108.9**醒神開郁方低劑量組1.50 406.1±66.8** 330.9±47.0** 488.8±66.9醒神開郁方中劑量組3.00 458.4±92.1** 353.4±54.8** 514.5±72.4*醒神開郁方高劑量組6.00 507.8±72.8** 380.7±40.8** 566.2±87.4**

4 討論

強迫游泳和懸尾實驗屬于行為絕望模型，是經典的抗抑郁藥物篩選模型，被廣泛用于抗抑郁藥物的研究。但這兩種模型也存在一定的局限性，一些增加動物活動的興奮性藥物也可能出現假陽性結果。自主活動實驗可以有效的反映動物自發行為、活動及情緒狀態，其活動強度在一定程度上也可反映中樞神經系統的興奮或抑制狀態[11]。本研究中小鼠自主活動實驗結果顯示，空白對照組小鼠自主活動次數均值202.1次，醒神開郁方低、中、高劑量組小鼠自主活動次數均值分別為189.3次、201.8次和192.5次；各組間比較無顯著性變化，表明醒神開郁方對小鼠自主活動無顯著性影響。

小鼠在懸尾及強迫游泳實驗中出現的不動狀態反映了動物的絕望行為，可模擬人類的抑郁狀態。懸尾和強迫游泳實驗結果顯示，醒神開郁方能顯著縮短小鼠懸尾和強迫游泳不動時間，表明其具有較強的抗抑郁作用，對中樞神經系統無興奮或抑制作用，其抗抑郁作用并非中樞興奮或抑制作用所致，可能是通過參與調節中樞不同單胺能神經傳導功能所產生抗抑郁作用[12]。

抑郁癥發病機制至今未明確闡明，但大量實驗研究表明單胺類神經遞質尤其是5-HT、NE以及DA含量改變與抑郁癥有密切關系[13]；也有報道指出腦內單胺類遞質缺乏或相對不足是導致抑郁癥的最直接因素[14-15]。利血平誘導體溫下降實驗是研究抗抑郁藥物作用機理經典實驗之一，該方法簡單可靠。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，它使遞質留在囊泡外，易被單胺氧化酶降解，從而使NE、DA和5-HT等耗竭，引起體溫下降、上眼瞼下垂、少動等癥狀。本實驗結果顯示，醒神開郁方能顯著提高小鼠腦組織內單胺類神經遞質NE、5-HT、DA含量，提示其抗抑郁作用的機制與增加腦內單胺類神經遞質的含量，調節NE、5-HT和DA能神經的活性有關。醒神開郁方可通過改變中樞單胺遞質的含量，繼而影響其他系統功能活動從而發揮抗抑郁作用。

綜上，醒神開郁方抗抑郁作用療效顯著，由于中藥方劑具有多成分、多環節、多靶點的作用特性，故對醒神開郁方中具有抗抑郁作用的活性部位、活性成分及其他抗抑郁作用機理的闡明尚需進一步的研究。