肺氣腫合并間歇低氧大鼠模型肝臟的氧化應激及炎癥損傷*

劉亞萌 高夢麗 曹 潔 馮 靖 陳寶元

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）和阻塞性睡眠呼吸暫停（obstruc?tive sleep apnea，OSA）目前均被認為可能是一種系統性疾病[1-2]。OSA間歇低氧（intermittent hypox?emia，IH）模式類似于缺血/再灌注，為OSA引起機體損傷的主要的病生理基礎。研究發現IH 4周后，肝臟比心血管系統可能遭受更嚴重的氧化應激及炎癥損傷[3]。氧化應激和炎癥反應在COPD的發生、發展及急性加重過程中同樣也發揮著重要作用[4]。同時罹患COPD和OSA即Flenley所謂的“呼吸重疊綜合征（overlap syndrome，OS）”。目前關于OS的肝臟的氧化應激及炎癥損傷臨床和實驗研究較少，本研究建立肺氣腫合并睡眠IH大鼠模型，旨在探討該模型肝臟的氧化應激及炎癥損傷特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 60只健康雄性Wistar大鼠，清潔級，6周齡，質量150～180 g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心。用隨機數字表法分為4組，分別為正常組（A組）、肺氣腫組（B組）、間歇低氧組（C組）及肺氣腫合并間歇低氧組（D組），每組15只。

1.1.2 試劑和儀器 （1）大前門烤煙型香煙（焦油含量約23 mg/支，尼古丁含量約1 mg/支）購自天津卷煙廠；混合氣體購自天津六方氣體公司；HE染色液，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒，ELISA試劑盒均夠自南京建成生物科技公司。（2）熏煙箱（容積約72 L）和密封箱均為儲物箱和大號密封盒改制；氧濃度檢測儀為瑞士夏美頓公司生產；低流量流速表為余姚工業自動化儀表廠生產；氧氣減壓器購自天津減壓器廠；血氣分析儀為瑞士羅氏AVL 995；日本Olympus光學顯微鏡及圖像采集系統；北京航空航天大學多功能彩色病理圖像分析系統；可見光分光光度計、微量式移液器、組織勻漿器、37℃烤箱和酶標儀均由天津醫科大學內分泌研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 肺氣腫合并睡眠間歇低氧大鼠模型的建立 A組：正常飼養，不予處理。B組：常氧狀態，每天熏煙2次，每次30 min。C組：每天于9:00—17:00以5%O2/平衡N230 s和空氣90 s交替通氣約8 h/d。D組：每天熏煙2次，每次30 min，于9:00—17:00以5%O2/平衡N230 s和空氣90 s交替通氣約8 h/d。按以上條件連續飼養8周。

1.2.2 標本的留取與處理 試驗開始8周后，從各組隨機抽取5只大鼠，取股動脈血測定其血氣值。將各組剩余的10只大鼠麻醉后在操作臺上仰臥位固定，取肺、肝臟組織各1塊，置于4%甲醛溶液中固定，24 h內石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。取一塊肝臟組織充分研磨后，嚴格按SOD、MDA及CAT測定試劑盒的說明操作，測定其濃度。取1塊約100 mg肝組織置于液氮中，充分剪碎勻漿后離心收集上清，用ELISA試劑盒測定肝臟白細胞介素（IL）-6及腫瘤壞死因子（TNF）-α水平。

1.2.3 肺組織病理半定量圖像分析 肺泡腔及肺泡密度的測量及計算。（1）肺平均內襯間隔（MLI）：以視野正中為中心劃“十”字交叉線，計數通過該交叉線的肺泡間隔數（Ns），測出十字線的總長度（L），以L/Ns得到MLI，該數值可反映肺泡平均直徑（μm）。（2）平均肺泡數（MAN）：計數每個視野內的肺泡數（Na），測出每個視野的面積（S）約為1.89 mm2。以Na/S計算各個視野的MAN，其數值可反映肺泡密度[5]。

1.2.4 觀察指標及肝臟炎癥評分方法 炎細胞浸潤程度（未見炎細胞浸潤為正常，偶見炎細胞浸潤為較輕，少量炎細胞浸潤為中度，大量炎細胞浸潤為重度）、炎細胞浸潤范圍（未見炎細胞浸潤為正常，每視野炎細胞的浸潤在5%以下為較輕、5%～10%為輕度、11%～20%為中度、21%～50%為較重、50%以上為重度）、肝細胞水腫程度（肝細胞未見水腫為正常，肝細胞胞漿疏松為較輕，肝細胞腫脹為中度，肝細胞腫脹破裂為重度）、肝細胞水腫范圍及肝細胞點狀壞死范圍（同炎癥細胞浸潤范圍判斷標準）。以上每項均按正常0分，較輕1分，輕度2分，中度3分，較重4分，重度5分，滿分為5分。每只大鼠的病理切片隨機讀取3個視野，每項指標表示為該指標實際得分占所能獲得最高預計分數（5分×5項）的百分比[6]。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件處理，數據均做正態性檢驗和方差齊性檢驗，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較應用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni法，相關性分析采用Pearson法，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預實驗各組大鼠的血氣值 A組大鼠數據基本符合正常生理狀態下的血氣值；B組p（O2）略有下降，基本符合大鼠肺氣腫的狀態；C組和D組大鼠p（O2）＜60 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），基本符合大鼠間歇低氧的狀態，各組大鼠血氣值見表1。

Table 1 The blood gas analysis of preliminary experiment in four groups of rats表1 預實驗各組大鼠血氣值 （n=5，±ss）

Table 1 The blood gas analysis of preliminary experiment in four groups of rats表1 預實驗各組大鼠血氣值 （n=5，±ss）

SaO2：動脈血氧飽和度

組別A組B組C組D組pH值7.41±0.01 7.38±0.02 7.41±0.01 7.37±0.02 p（O2）（mmHg）109.00±3.81 84.80±3.96 50.00±2.74 47.80±3.56 p（CO2）（mmHg）39.20±2.39 43.60±2.07 34.60±0.89 44.20±2.28 SaO2 0.99±0.05 0.95±0.02 0.86±0.02 0.83±0.03

2.2 肺泡腔及肺泡密度測量結果 經肺組織半定量分析其各組大鼠的肺泡密度，B、D組符合肺氣腫形成標準。B、D組MLI均大于A、C組，B、D組MAN均低于A、C組，見表2。

2.3 肝臟氧化應激及炎癥反應的指標比較 B、C和D組大鼠肝臟總SOD及CAT的活力值均低于A組，且D組明顯低于B、C組。B、C和D組大鼠肝臟的MDA水平均高于A組，且D組明顯高于B、C組。B、C、D組肝臟IL-6、TNF-α的含量及肝臟炎癥損傷病理評分均高于A組，且D組肝臟IL-6、TNF-α的含量及肝臟炎癥損傷病理評分明顯高于B、C組，見表3。

Table 2 Comparison of MLI and MAN values between four groups of rats表2 各組大鼠MLI及MAN結果比較 （n=10，x±s）

Table 3 Indicators of liver oxidative stress and inflammatory response表3 肝臟氧化應激及炎癥反應的指標 （n=10，x±s）

2.4 炎性因子與肝損傷程度的相關性分析 肝臟IL-6、TNF-α的含量與肝臟炎癥損傷的評分呈正相關（r分別為0.743、0.929，均P＜0.001）

3 討論

3.1 既往關于單純COPD及單純OSA肝臟損傷的研究 COPD的肝臟損傷已經被大家廣為認識。COPD被認為既是氧化應激性疾病，又是全身炎癥反應性疾病[7]。研究發現，肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、酒精肝等肝病的發生、發展與自由基損傷有關，氧化應激可能是肝病的共同發病機制[8]。因此，肝臟作為機體代謝的主要器官，COPD引起的全身氧化應激水平的升高和炎癥反應勢必會影響肝臟。在一項關于2 284例COPD患者1～3年的調查研究中發現，至少14%COPD患者存在肝功能的異常[9]。近年來，OSA導致肝臟損傷的研究也越來越受到重視。大量的實驗和臨床研究將OSA和肝損害聯系起來。研究發現小鼠暴露于IH環境35 d即可出現肝臟SOD等抗氧化酶活性的降低，導致肝臟的氧化應激損傷[10]。慢性IH可通過氧化應激和激活前炎性轉錄因子，如核因子（NF）-κB，造成肝臟損傷[11]。

3.2 氧化應激及炎癥損傷指標的確立 SOD和CAT均是生物體內重要的抗氧化酶，可以清除生物體內的自由基,對抗和阻斷氧自由基對細胞造成的損害。MDA是氧自由基攻擊細胞膜脂質過氧化的代謝終產物。SOD、MDA、CAT的高低可以反映機體或組織的氧化應激狀態。IL-6及TNF-α為重要的炎癥反應前介質。目前認為氧化應激和炎癥反應均與COPD及OSA的肺外并發癥有關[1,12]，因此測定肝臟SOD、MDA、CAT、IL-6及TNF-α的水平可以反映COPD及OSA的肝臟氧化應激及炎癥損傷狀態。

3.3 研究發現及原因 本研究發現肺氣腫組、間歇低氧組和肺氣腫合并間歇低氧組肝臟SOD、CAT水平均低于正常對照組，而肝臟MDA、IL-6、TNF-α的水平及肝臟的炎癥損傷評分均高于正常對照組。提示IH和肺氣腫均可引起肝臟氧化與抗氧化的失衡及炎癥反應，與既往的研究結果一致[6,13-14]。但本研究同時發現肺氣腫合并間歇低氧組的肝臟SOD、CAT水平明顯低于單純肺氣腫和單純間歇低氧組，肝臟MDA、肝臟IL-6、TNF-α的水平及炎癥損傷評分明顯高于單純肺氣腫和單純間歇低氧組，推測IH和肺氣腫可以協同降低肝臟的抗氧化能力，打破氧化與抗氧化之間的平衡，加重肝臟的氧化應激程度，同時導致NF-κB激活增加，NF-κB的增加導致IL-6及TNF-α等炎癥因子大量釋放，炎癥因子再激活NF-κB，級聯放大加重肝臟的炎癥反應，導致細胞和組織損傷加重。低氧可以導致機體或組織的氧化應激及炎癥損傷，且低氧的程度和機體或組織的氧化應激及炎癥損傷水平呈正相關。研究發現，COPD合并OSA時較單純OSA或單純COPD的低氧程度加重[15-16]，且OSA間歇低氧模式引起機體氧化應激及炎癥損傷主要是在再氧合的過程中[17-18]，因此再氧合的過程進一步加重低氧導致的氧化應激及炎癥損傷。因此OS低氧和再氧合均可能是COPD和OSA引起肝臟氧化應激和炎癥損傷過程中存在協同作用的原因。

[1]Albu A,Fodor D,Poant? L,et al.Markers of systemic involvement in chronic obstructive pulmonary disease[J].Rom J Intern Med,2012,50（2）:129-134.

[2]Gonzalez NC,Wood JG.Alveolar hypoxia-induced systemic inflam?mation:what low PO（2）does and does not do[J].Adv Exp Med Bi?ol,2010,662:27-32.

[3]Jun J,Savransky V,Nanayakkara A,et al.Intermittent hypoxia has organ-specific effects on oxidative stress[J].Am J Physiol Regul In?tegr Comp Physiol,2008,295（4）:R1274-1281.

[4]Lin JL,Thomas PS.Current perspectives of oxidative stress and its measurement in chronic obstructive pulmonary disease[J].COPD,2010,7（4）:291-306.

[5]Mapel DW,Marton JP.Prevalence of renal and hepatobiliary dis?ease,laboratory abnormalities,and potentially toxic medication ex?posures among persons with COPD[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2013,8:127-134.

[6]Feng J,Chiang AA,Wu Q,et al.Sleep-related hypoxemia aggravates systematic inflammation in emphysematous rats[J].Chin Med J（Engl）,2010,123（17）:2392-2399.

[7]Biljak VR,Rumora L,Cepelak I,et al.Gamma-glutamyltransferase and C-reactive protein in stable chronic obstructive pulmonary disease[J].Coll Antropol,2013,37（1）:221-227.

[8]Muriel P.Role of free radicals in liver diseases[J].Hepatol Int,2009,3（4）:526-536.

[9]McKenzie DK,Butler JE,Gandevia SC.Respiratory muscle function and activation in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Appl Physiol,2009,107（2）:621-629.

[10]Rosa DP,Martinez D,Picada JN,et al.Hepatic oxidative tress in an animal model of sleep apnoea:effects of different duration of expo?sure[J].Comp Hepatol,2011,10（1）:1.

[11]姜秋芳,陳寶元,董麗霞,等.慢性間歇低氧對大鼠肝臟的損傷及4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶的干預作用[J].中華結核和呼吸雜志,2012,35（3）:189-192.

[12]Lurie A.Inflammation,oxidative stress,and procoagulant and throm?botic activity in adults with obstructive sleep apnea[J].Adv Cardiol,2011,46:43-66.

[13]da Rosa DP,Forgiarini LF,Baronio D,et al.Simulating sleep apnea by exposure to intermittent hypoxia induces inflammation in the lung and liver[J].Mediators Inflamm,2012;2012:879419.

[14]Feng J,Wang QS,Chiang A,et al.The effects of sleep hypoxia on coagulant factors and hepatic inflammation in emphysematous rats[J].PLoS One,2010,5（10）:e13201.

[15]Lacedonia D,Carpagnano GE,Aliani M,et al.Daytime PaO2 in OSAS,COPD and the combination of the two（overlap syndrome）[J].Respir Med,2013,107（2）:310-316.

[16]Lee R,McNicholas WT.Obstructive sleep apnea in chronic obstruc?tive pulmonary disease patients[J].Curr Opin Pulm Med,2011,17（2）:79-83.

[17]馮靖,陳寶元,郭美南，等.內皮細胞在不同間歇缺氧方式時核因子κB和細胞間黏附分子1的變化[J].中華結核和呼吸雜志,2007,30（3）:202-206.

[18]高夢麗,劉春霞,馮靖,等.不同間歇低氧方式對內皮細胞c-fos mRNA表達水平的影響[J].天津醫藥,2013,41（10）：945-948.