煙草正反交組合F1 SRAP的比較分析

朱列書 詹莜國 郭東海 宋正雄 王祖富 尹佳

(1.湖南農業大學中國煙草中南農業試驗站,湖南長沙 410128;2.昆明市煙草公司,云南昆明 650202)

煙草正反交組合F1 SRAP的比較分析

朱列書1詹莜國2郭東海1宋正雄1王祖富1尹佳1

(1.湖南農業大學中國煙草中南農業試驗站,湖南長沙 410128;2.昆明市煙草公司,云南昆明 650202)

本文旨在利用SRAP 標記對4X4完成雙列雜交煙草組合進行差異比較,從遺傳層面鑒定正反交差異。100對SRAP引物組合中只有me3-em2、me4-em6、me6-em5、me10-em7引物組合能4 X 4個組合中擴增出差異條帶,但是沒能在正反交F1之間擴增出特異條帶。表明SRAP標記在鑒別種內之間的差異時效率不高。

烤煙 SRAP分子標記 差異

0煙草(Nicotiana tabacum L.)為茄科煙屬一年生或多年生作物，為典型的自交作物，是最早應用于分子生物學和基因工程研究的模式植物之一。但我國煙草種植品種單一化，嚴重阻礙了煙草產量和質量的進一步提高。究其原因除煙草育種目標固有復雜性與特殊性以外，主要是煙草育種還依賴于植株的表型選擇及一些生理生化指標的測定，未曾從遺傳的層面研究應用科學問題，使煙草育種的進展受到一定的限制。近年發展起來的分子標記技術克服了形態性狀研究的不足，不受發育時期的影響，結果可靠，因此被廣泛使用。而其它作物種，分子標記輔助育種選擇體現了它的優勢。

SRAP(Sequence-Related AmplifiedPolymorphism)標記是Li和Quiros[96，97]在蕓苔屬植物上開發出的新型分子標記技術，已在馬鈴薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、[98-100]中成功擴增。其原理是利用特定引物對ORFs區域(Open Reading Frames)進行擴增。因不同個體、物種的內含子、啟動子及間隔區長度不同而產生多態性。目前，該技術已被用于甜瓜、南瓜、野牛草、辣椒和棉花[101]等的遺傳多樣性研究，顯示了良好的效果和適用性。

本文旨在利用SRAP標記對4X4完成雙列雜交煙草組合進行差異比較，從遺傳層面鑒定正反交差異。從分子水平了解煙草的遺傳變異和親緣關系，為合理選配親本，挖掘利用現有種質資源提供理論指導；為加快我國煙草育種效率提供理論參考依據。

表1 4×3正反雜交組合

表2 親本的主要特征特性

1 材料與方法

1.1 材料

選用材料以紅花煙草(Nicotiana tabacum)中的DY87、長脖黃、T61、PVH06共4個烤煙品種為親本，按Griffing方法I進行4×4完全雙列雜交，配制正反、交組合12個，連同親本共16個(見表1，表2)。

1.2 儀器與試劑

高速冷凍離心機(日本，Hitachi koki co，ltd)，核酸蛋白檢測儀(德國，Eppendorf，Biophometer)、紫外凝膠成像系統(GelDoc-1000)、HVE-50高壓滅菌鍋、電泳槽、移液槍(0.2-2μL、2-20μL、20-200μL、1mL)、超低溫冰箱、低溫冰箱、Biometra基因擴增儀、電磁爐

表3 正向引物堿基序列

用于SRAP-PCR反應的Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer(Mg2+15mM)購自東盛生物公司，標準分子量(Marker)DL100購自GenScript。SRAP引物由上海生物工程公司合成。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Tiangen公司。

1.3 基因組DNA的提取(CTAB法)與濃度測定

采集新鮮幼嫩的葉片約2g，放入研缽中，用液N2研磨成粉末，DNA的提取采用CTAB法，參考王關林、王宏建等[102]的方法并稍做改進，提取步驟為：

①在CTAB提取液中先加入200μL的β-巰基乙醇，水浴鍋中預熱到65℃；

②往裝有粉碎樣品的離心管中加入65℃預熱的DNA的提取液[2%CTAB，100mmol Tris/HCl(pH8.0)，1.4mol NaCl，20mmolEDTA(pH8.0)，用前加40mmol/L β-巰基乙醇]4mL，輕輕搖晃均勻，在65℃水浴45min，每5min溫和翻轉一次；

③取出試管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，溫和上下顛倒50次左右，至下層液相呈深綠色為止，于15℃，12000r/min離心10min；

④將上清液轉移到另一離心管，重復以上操作再用氯仿/異戊醇(24：1) 抽提一次；

⑤取上清液于離心管中，加入等體積的-20℃的異戊醇，溫和顛倒數次，-20℃冰箱中放置15min，于4℃，10000r/min 離心10min；

⑥倒掉液體后用75%的酒精清洗兩次后，于超凈工作臺上晾干，將晾干的DNA溶于100μLTE溶液中。

得到的DNA提取液用Eppendorf公司生產的BioPhotometer核酸檢測儀檢測DNA溶液濃度與純度，用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性，最后將樣品稀釋成20ng/μL，保存于-20℃下備用。

表4 反向引物堿基序列

表5 SRAP-PCR反應各因素的水平

表6 PCR反應的因素水平試驗設計

1.4 PCR引物

SRAP是建立在PCR基礎上的一種新型分子標記，以PCR為基礎的分子標記系統的引物的一般設計原則也適用于SRAP：不能產生二聚體、不能形成發夾結構、GC含量在40%—60%等。SRAP標記的引物分為正反兩種，正向引物長為17bp，由14bp的核心序列和3'端的3個可選擇性堿基組成，核心序列由5'端的10bp填充序列和緊接著的CCGG組成，3'端的3個堿基的變化能產生一系列的引物。反向引物長為17bp或18bp，組成與正向引物相同，核心序列長10bp或11bp，組成必須與正向引物不同，在核心序列與3'端可選擇性堿基之間是AATT，具體序列如下(如表3，4)：

1.5 PCR反應因素水平的確定與體系設計

PCR反應受多個因素影響，反應復雜，為了確定PCR反應中5個因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)的最佳水平，參考陳萬勝[103]的正交設計，簡化為三個水平進行試驗，參加PCR反應的因素水平見表3-3，設計方案見表5。

圖1 提取的總DNA

圖2 試驗設計SRAP-PCR產物電泳結果

圖3 品種試驗結果(me3-em2)

1.6 PCR擴增與檢測

將表6的12個處理重復兩次，在Biometra基因擴增儀上進行擴增反應，反應程序首先是94℃預變性5min；前5個循環程序為：94℃，1min，35℃，1min，72℃，2min；隨后的35個循環為：94℃，1min，53℃，1min，72℃，2min；最后72℃延伸5min，4℃保持。PCR擴增產物與6×點樣緩沖液混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE溶液，電壓80V，電泳時間約45min，電泳結束后在GelDoc-1000紫外凝膠成像系統上采集圖像。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

DNA的提取質量是決定SRAP-PCR成功與否的關鍵。改良的CTAB法提取的DNA經核酸蛋白檢測儀檢測OD260/OD280為1.91±0.05，OD260/OD230為1.96±0.06，表明無多糖、蛋白質和酚類物質等雜質干擾；經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA主帶明亮清晰(圖1)，點樣孔沒有雜質遺留，得到的樣品純度比較高。

2.2 SRAP反應體系的優化

按表6設計的12個處理進行PCR擴增反應后，所得到的產物用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測(圖2)。從圖可以看出，體系8、10、11和12擴增的條帶數很少且不清楚，說明Tap酶單位和引物濃度加大效果并不理想；1、3和4能擴增出一定數量的條帶，但是都不是很清晰，可以看出Tap酶1.0U偏少，dNTP濃度0.15mmol/L偏小；2號體系能擴增出較多清晰的條帶，5、6和7也能擴增出比較清晰的條帶，由此可以看出Tap酶為1.5U、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L最好，引物濃度0.2μmol/L就可以了，DNA模板對結果影響并不很明顯，40ng能夠滿足體系擴增要求。

2.3 應用SRAP反應體系擴增不同烤煙品種基因組

采用優化的SRAP反應體系擴增4×4完全雙列雜交16個烤煙品種(系)基因組，共擴增了100對引物，每一對引物組合都能擴增出一定數量的清晰條帶，但是其中有差異條帶的只有4對，它們分別是me3-em2、me4-em6、me6-em5、me10-em7，圖譜如下。在引物對me3-em2擴增下親本T61與其他親本相比在大約700bp處缺少一個條帶；而組合“長脖黃×61”在1200bp處缺少條帶，但正反交(3號10號)之間沒有條帶差異。14號親本PVH06在引物對me4-em6的擴增下與其親本相比較在250bp處缺少條帶，由其組配的雜種沒有相應的缺失條帶；同時其它正反交F1也沒有相應的缺失。引物對Me6-em5能在親本T61中擴增出兩個特異條帶，分別在大約在1500bp、900bp處。其組配的雜種F1沒有檢測到相關相同條帶，這可視為親本T61的特異標記條帶。DY87在引物對me10-em7的擴增下，在1500bp和1000bp兩處缺少條帶，正反交F1之間沒有檢測到條帶差異。

圖4 品種試驗結果(me6-em5)

圖5 品種試驗結果(me10-em7)

圖6 品種試驗結果(me4-em6)

3 小結與討論

3.1 DNA提取與SRAP反應體系

改良的CTAB法提取DNA效果比較好，可以完成DNA提取，快速、簡易、低成本，去除了蛋白質、糖、酚類等雜質，能夠滿足SRAP體系對模板的要求。

SRAP分子標記技術基于PCR反應，其擴增譜帶雖較RAPD標記穩定，但同樣受反應條件和擴增程序變化以及物種不同的影響，DNA模板質量，不同廠家生產的Tap酶，PCR反應的緩沖液以及各成分的濃度均能影響實驗結果，采用不同的體系組合對煙草的SRAP-PCR擴增結果影響很大，因此，有必要根據具體情況優化反應體系。SRAP體系優化的方法有多種，一般均采用多次單因素設計的方法。本試驗在簡化正交設計的基礎上，得出了煙草SRAP最佳反應體系(20uL)：Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L，引物0.2umol/L、Tap聚合酶1.5U、DNA模板40ng。

PCR擴增還跟退火溫度密切相關，引物不同，其退火溫度也不同[11，12]。溫度高，擴增產物的特異性強，溫度低，擴增產物的產量高。本研究的擴增程序為94℃預變性5min，前5個循環程序為：94℃，1min，35℃，1min，72℃，2min，隨后的35個循環為：94℃，1min，53℃，1min，72℃，2min；最后72℃延伸5min，4℃保持。

3.2 SRAP正反交F1差異鑒定

SRAP作為一種新型的分子標記技術，具有簡便、高共顯性、重復性好、條帶分離清晰等優點，廣泛應用于物種內部系統樹的構建、親緣關系的確定等，顯示了比較好的作用。本研究將SRAP應用于4×4完全雙列雜交的基因組差異分析，SRAP擴增效果良好，產率中等，條帶清晰，可以在煙草中產生多態，但是品種間的多態性條帶很少，100對引物組合中只有me3-em2、me4-em6、me6-em5、me10-em7等4個引物組合能擴增出差異條帶，但正反交F1之間沒有擴增出特異條帶。表明SRAP標記在鑒別種內之間的差異時效率不高。因為在農藝性狀和生理指標中，親本與正反交F1的方差分析表明存在極顯著或者顯著差異。

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SRAP was used to compare differences of 4x4 Flue-cured Tobacco combinations by diallel crosses excluding reciprocal and identify reciprocal differences of Heredity. Amplified bands were only detected by me3-em2 prime pair、me4-em6 primer pair、me6-em5 primer pair and me10-em7 primer pair in the 100 primer pairs of 4x4 Flue-cured Tobacco combinations but specific bands were not amplified between Reciprocal Crosses Hybrids F1.The results showed that the efficiency of identification intraspecific differences was not high by SRAP.

Flue-cured tobacco SRAP Difference

國家煙草專賣局煙草育種重大專項[中煙辦〔2010〕221號]文合同編號:110201002007。