4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯通過PTEN/PI3K/Akt抑制YAC-1細胞增殖和誘導其分化

彭曉清，陳飛虎，葛金芳，汪 楠，潘春曉，雷 靜

(安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032)

全反式維甲酸 (all trans retinoic acid，ATRA)在細胞生長和分化過程中起重要調節作用，常做化療藥物和腫瘤形成抑制劑［1］。眾所周知，ATRA能誘導急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)細胞逐漸向正常細胞分化從而達到治愈目的，但長期用藥導致維甲酸綜合征［2］和耐藥［3］等不良反應。本課題組前期以ATRA為先導化合物進行了結構優化和篩選，結果表明4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)可抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導其分化成熟［4，9］，并已申請自主知識產權(專利公開號:CN101591280、CN102008443A)，有望成為一種新型抗腫瘤藥物。

cyclinD在淋巴瘤的發生過程中起重要作用。有研究證實在淋巴瘤細胞中抑制Akt磷酸化從而降低cyclinD過表達能抑制腫瘤細胞生長［5］。PTEN/PI3K/Akt是經典信號通路之一，在腫瘤中研究較為廣泛［6］，但是在誘導分化中的研究卻很少。因此本研究以鼠淋巴瘤細胞株YAC-1為研究對象，通過體外實驗觀察ATPR對鼠淋巴瘤細胞增殖及分化的影響，并探討PTEN/PI3K/Akt通路和cyclinD在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 新型維甲酸衍生物ATPR由安徽醫科大學藥學院合成。純度為99.66%，溶于無水乙醇，配置成1×10－2mol·L－1濃度(使用終濃度中乙醇含量為0.02%)，－20℃儲存備用。RPMI 1640培養液為Gibco公司產品;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;瑞氏－吉姆薩染液購自南京建成生物工程研究所;LY294002和LDH乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天公司;全反式維甲酸ATRA和TPA購自美國Sigma公司;NBT購自Amresco公司;逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均為Promega公司產品;PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;抗RARα抗體、抗RARβ抗體、抗PTEN抗體購自安博公司;抗RARγ抗體購自Abcam公司;抗β-actin、抗cyclinD抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司;抗Akt、抗p-Akt抗體購自Cell Signal公司;ECL化學發光劑購自Thermo公司。

1.2 細胞培養 YAC-1細胞株購自中科院細胞庫，采用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養液，并加入青霉素0.1 IU·L－1和鏈霉素 100 mg·L－1的培養體系培養。培養環境為37℃，5%的CO2培養箱，每2 d換液1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖狀況 將YAC-1細胞以5×103個/孔的濃度接種于96孔培養板中，每孔為100 μl。實驗分組分為空白對照組(加入RPMI 1640培養液)、溶劑對照組(0.02%無水乙醇)、ATRA 組(為陽性對照組，濃度為 10－5mol·L－1)、ATPR 組(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)，每孔的終體積為 200 μl，分別在 24、48、72 h 時加入 MTT(濃度為 5 g·L－1)20 μl，繼續培養 4 h 后，離心(159 ×g，5 min)棄上清，每孔加入150 μl的 DMSO，震蕩搖勻。酶聯免疫檢測儀測吸光度(A490)值，每組設5個復孔，重復3次，取其平均值。

1.4 LDH法檢測細胞毒性 將YAC-1細胞以5×103個/孔的濃度接種于96孔培養板中，每孔為100 μl。實驗分組為無細胞的培養液孔(背景空白對照孔)，未經藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔)，未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及“1.3”中的實驗組別，終體積為200 μl。72 h 在樣品對照空加 LDH 釋放液20 μl，混勻，孵育1 h，離心(159 × g，5 min)吸取上清 120 μl轉移至新的96孔板中，每孔加入LDH檢測工作液60 μl，室溫孵育30 min。酶聯免疫檢測儀測吸光度(A490)值，每組設5個復孔，重復3次，取其平均值。

1.5 細胞形態學觀察 將細胞以4×105個/孔的濃度接種于6孔板中，實驗分組如“1.3”，每孔終體積2 ml。作用72 h后，收集細胞離心，加PBS重懸、混勻，滴加在載玻片上，自然風干后，依次滴加瑞氏－吉姆薩染液A液和B液。流水沖洗細胞，干燥后在顯微鏡(400×)下觀察細胞形態，并拍照。

1.6 NBT還原實驗 將細胞以4×105個/孔的濃度接種于6孔板，實驗分組如“1.3”，作用72 h后，收集細胞。取500 μl新鮮配置含100 mg·L－1TPA的0.1%NBT溶液，分別與等體積經不同處理后的細胞懸液混合，37℃孵育30 min后，離心去上清，沉淀涂片。每組設3個復孔，每孔觀察4個視野，計數NBT陽性細胞(胞質含藍灰色顆粒的細胞為陽性細胞)，根據以下公式計算每個復孔的NBT陽性率，比較組間差異。

1.7 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blot法檢測細胞 RARα，RARβ和 RARγ表達

1.7.1 RNA提取和 RT-PCR 將細胞以4×106個/孔的濃度接種于培養瓶中，實驗分組為空白對照組(加入RPMI 1640培養液)、溶劑對照組(0.02%無水乙醇)、ATRA組(為陽性對照組，濃度為10－5mol·L－1)、ATPR 組(10－5mol·L－1)。藥物作用細胞72 h后，按逆轉錄試劑盒結合說明書及引物反應條件進行逆轉錄和目的基因擴增，檢測RARα、RARβ、RARγ基因的表達。各種引物序列和擴增產物長度見 Tab 1。循環條件:94℃預變性5 min;94℃變性40 s，退火 RARα (53℃)、RARβ (50℃)、RARγ (53℃)、β-actin(53℃)40 s，延伸72℃1 min。35個循環后72℃延伸10 min。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳(80 V，30 min)，用凝膠自動成像2 000掃描和分析結果，以β-actin為內參作相對定量分析。以3次實驗結果做統計學分析。

Tab 1 Oligonucleotide primer sequences used for RT-PCR analysis

1.7.2 Western blot 藥物作用72 h后，棄培養液，用預冷PBS洗滌3遍，每瓶加入400 μl RIPA裂解液(含10%PMSF)裂解30 min，將細胞轉移到1.5 ml EP管中，離心取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將上清與上樣緩沖液按4∶1的比例進行分裝，100℃煮10 min變性，－80℃保存待用。50～100 μg蛋白經12%SDS-PAGE膠分離后轉移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min。含5%脫脂奶粉(TBST溶解)封閉2h。隨后加入一抗 (1∶500)4℃孵育過夜。TBST洗脫3次，每次5 min，孵育二抗1 h，TBST洗脫4次。均勻涂化學發光劑ECL于PVDF膜上，在Bioshine chemiQ4600曝光設備上曝光拍照。結果采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統分析。

1.8 Weston blot檢測 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD的表達 設空白對照組(加入RPMI 1640培養液)、溶劑對照組(0.02%無水乙醇)、ATRA組(為陽性對照組，濃度為 10－5mol·L－1)、ATPR 組(10－5mol·L－1)、LY294002 抑 制 劑 組 (25 nmol· L－1)，LY294002(25 nmol·L－1)+ATPR 組(10－5mol·L－1)，檢測 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD 蛋白的表達變化。實驗步驟如“1.7.2”。

2 結果

2.1 ATPR對YAC-1細胞生長的抑制作用 如Tab 2所示，與空白對照組相比，溶劑對照組并無明顯變化，表明無水乙醇(0.02%)作為溶劑對細胞增殖無影響，因此可排除溶劑對本實驗的影響。ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)體外給藥42 h和72 h對細胞產生不同程度的抑制作用，72 h抑制作用較強，并隨著藥物濃度升高抑制作用增強。

Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of YAC-1 cells detected by MTT assay(±s，n=3)

Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of YAC-1 cells detected by MTT assay(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs solvent group

GroupConcentration/mol·L －1 A490 24 h 48 h 72 h Control 0.1483 ±0.0048 0.4800 ±0.0078 0.9240±0.0130 Solvent 0.1449 ±0.0044 0.4713 ±0.0090 0.9153 ±0.0073 ATPR 10 －5 0.1461 ±0.0043 0.3664 ±0.0073＊＊ 0.5921 ±0.0068＊＊10 －6 0.1471 ±0.0062 0.3869 ±0.0077＊＊ 0.6160 ±0.0090＊＊10 －7 0.1450 ±0.0065 0.4094 ±0.0062＊＊ 0.6737 ±0.0069＊＊10 －8 0.1490 ±0.0048 0.4521 ±0.0114* 0.7360 ±0.0064＊＊10 －9 0.1470 ±0.0043 0.4670 ±0.0071 0.8724 ±0.0084 ATRA 10 －5 0.1505 ±0.0056 0.4850 ±0.0048＊＊ 0.5768 ±0.0076＊＊

2.2 ATPR對YAC-1細胞毒性作用 如Fig 1所示，與溶劑組比較，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)體外用藥72 h后，隨著藥物濃度的升高，藥物對細胞毒性增強，以藥物濃度10－6mol·L－1細胞毒性升高最為明顯(0.244±0.013)，與溶劑對照組比較(0.077±0.008)，差異具有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 ATPR對細胞形態學影響 YAC-1細胞在ATPR(10－5～10－9mol·L－1)作用72 h 后，瑞氏 －吉姆薩染色后顯微鏡(400×)觀察顯示，和空白組和溶劑對照組細胞相比，ATPR(10－5mol·L－1)細胞生長緩慢，生長疏松，細胞數量減少，核質比減少，腫瘤細胞特點有一定改善。見Fig 2。

2.4 ATPR對分化細胞陽性率的影響 如Tab 3所示，與溶劑組比較，ATPR(10－9mol·L－1)作用 72 h后對YAC-1細胞NBT陽性細胞率無影響。但隨著 ATPR 劑量增加(10－5～10－9mol·L－1)，NBT 的陽性細胞率逐漸增加，并具有統計學意義(P＜0.01)，當劑量增加到 10－5mol·L－1時，其誘導分化作用與ATRA相似。提示ATPR可誘導YAC-1細胞分化。

Fig 1 Cell cytotoxicity of YAC-1 cells detected by LDH(±s，n=6)

Tab 3 Effect of ATPR on the NBT positive cell in YAC-1 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effect of ATPR on the NBT positive cell in YAC-1 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs solvent group

Group Concentration/mol·L －1Positive cell/%Control 5.00 ±2.00 Solvent 7.67 ±2.08 ATRA 10 －5 67.00 ±3.61＊＊ATPR 10 －5 65.30 ±2.52＊＊10 －6 53.00 ±4.00＊＊10 －7 38.00 ±2.00＊＊10 －8 27.67 ±3.79＊＊10－910.33 ±2.52

2.5 RARα、RARβ、RARγ mRNA 和蛋白的表達結果如Fig 3、4所示，與溶劑對照組比較，ATPR(10－5mol·L－1)作用 72 h 后，YAC-1 細胞 RARα的mRNA和蛋白表達量均明顯增加，而 RARβ、RARγ的mRNA和蛋白表達量則無明顯變化。

2.6 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD 蛋白的表達Western blot結果顯示，與溶劑對照組相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用72 h后，YAC-1細胞 PTEN 蛋白表達量增加，而cyclinD和p-Akt的蛋白表達則明顯降低。PI3K抑制劑LY294002也可抑制YAC-1細胞的p-Akt和cyclinD的表達，并且LY294002作用6 h后加入ATPR(10－5mol·L－1)組p-Akt和cyclinD的表達最低。見Fig 5。

3 討論

Fig 2 Effect of ATPR on the morphological changes of YAC-1 cells after 72 h(400×)

20世紀70年代，Sachs發現在某些抑制增殖和誘導分化的物質作用下小鼠白血病細胞系的異常分化是可逆的，因此提出了誘導分化治療(differentiation therapy)的概念，即應用化學藥物誘導腫瘤細胞分化并逆轉其增殖、浸潤、轉移等惡性表型，使其成為正常或接近正常細胞，從而達到治療的目的。全反式維甲酸是誘導分化治療的代表性藥物，對淋巴瘤等血液系統腫瘤有良好的治療作用［7］，但長期應用導致的耐藥性［2］及其他不良反應［8］限制了其臨床應用。本課題組前期研究中以ATRA為先導化合物設計合成了維甲酸衍生物ATPR，證實其可抑制食管癌、胰腺癌、宮頸癌等腫瘤細胞增殖和誘導分化［9］，但其對淋巴瘤的治療作用尚不明確。

Fig 3 RT-PCR analysis of YAC-1 cells retinoid acidreceptors mRNA expression after ATPR treatment(±s，n=3)

Fig 4 Effect of ATPR on protein expression of retinoid acid receptors in YAC-1 cells(±s，n=3)

Fig 5 Effect of ATPR on protein expression of PTEN，Akt，p-Akt，cyclin D in YAC-1 cells(±s，n=3)

本研究以鼠淋巴瘤YAC-1細胞為實驗對象，觀察了ATPR對淋巴瘤的治療作用。結果表明，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)體外用藥 72 h 可明顯抑制YAC-1細胞增殖，其中10－5mol·L－1ATPR 作用最為明顯，LDH實驗結果提示ATPR抑制YAC-1細胞增殖的作用可能與其細胞毒性作用相關。

細胞分化主要表現形態和功能兩個方面，形態分化是細胞分化的基本特征。形態學上的分化成熟是表明惡性腫瘤細胞分化的標志［10］。經過ATPR作用72 h的YAC-1細胞在形態學上有趨向高分化狀態的改變。NBT還原試驗是從功能及生物化學變化方面來反映細胞分化的常用指標，且是目前公認的反映細胞分化的敏感指標之一［11－12］。本研究結果表明，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)體外用藥72 h后YAC-1細胞的NBT細胞陽性率明顯升高。以上結果提示，ATPR可抑制鼠YAC-1細胞增殖并誘導其分化。

維甲酸類藥物經維甲酸結合蛋白轉運至細胞核內與核受體RARs或RXRs結合，激活目的基因，從而參與調控多種重要生理過程［13］。不同細胞中RARs分布不同，因此ATRA在不同細胞中可以激活不同的維甲酸受體亞基［14］。研究表明［7］，在淋巴瘤細胞中ATRA提高RARα和RXRγ介導的細胞周期阻滯和凋亡。本研究通過RT-PCR和Western blot方法觀察了ATPR對維甲酸受體RARs表達的變化，結果表明ATPR可誘導RARα的表達增加，但對RARβ和RARγ的表達無明顯影響，提示ATPR對YAC-1細胞的抑制增殖和誘導分化作用可能是通過和RARα結合實現。課題組前期研究結果表明ATPR對乳腺癌的抑制增殖和誘導分化作用則是通過調節 RARβ和 RARγ的平衡實現［4］。進一步證實維甲酸類藥物可通過不同腫瘤細胞中的不同RARs亞基發揮其治療作用。

腫瘤細胞中抑癌基因PTEN的缺失或表達下調可引起PIP3催化亞基的表達放大，進一步激活PI3K/Akt通路的磷酸化［15］。Dal Col等［5］在套細胞淋巴瘤中發現通過增加GSK-3促進Akt的依賴性蛋白酶降解，降低Akt的磷酸化，從而抑制cyclinD的過表達。本研究結果表明，ATPR(10－5mol·L－1)體外用藥72 h后YAC-1細胞的PTEN蛋白表達量增加，而cyclinD和p-Akt的蛋白表達則明顯降低。提示ATPR可能通過調節抑癌基因PTEN的表達，參與調節Akt的磷酸化和cyclinD表達發揮其抑制增殖和誘導分化作用。

綜上所述，ATPR可明顯抑制YAC-1細胞增殖并誘導其分化程度增高，其機制可能與結合RARα受體，繼而調控PTEN/PI3K/Akt通路及cyclinD表達有關。

［1］Feng D，Cao Z，Li C，et al.Combination of valproic acid and ATRA restores RARβ2 expression and induces differentiation in cervical cancer through the PI3K/Akt pathway［J］.Current Molecular Med，2012，12(3):342 －54.

［2］Dhar A K，Barman P K.Retinoic acid syndrome-cardiac complication［J］.J Assoc Physicians India，2012，60:63 －5.

［3］Tomita A，Kiyoi H，Naoe T.Mechanisms of action and resistance to all-trans retinoic acid(ATRA)and arsenic trioxide(As2O3)in acute promyelocytic leukemia［J］.Int J Hematol，2013，97(6):717－25.

［4］汪 楠，陳飛虎，葛金芳，等.4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對MCF-7細胞增殖和分化的影響極其機制研究［J］.中國藥理學通報，2013，29(6):767 －72.

［4］Wang N，Chen F H，Ge J F，et al.Effects of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on the proliferation and differentiation of MCF-7 cell and its possible mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(6):767 －72.

［5］Dal Col J，Zancai P，Terrin L，et al.Distinct functional signifi-cance of Akt and mTOR constitutive activation in mantle cell lymphoma［J］.Blood，2008，111(15):5142 －51.

［6］Carnero A，Blanco-Aparicio C，Renner O，et al.The PTEN/PI3K/AKT signalling pathway in cancer，therapeutic implications［J］.Current Cancer Drug Targets，2008，8(3):187 －98.

［7］Amareshwar T，Singh K，Andrew M，et al.All trans retinoic acid nanodisks enhance retinoic acid receptor mediated apoptosis and cell cycle arrest in mantle cell lymphoma［J］.British J Haematol，2010，5(9):158 －9.

［8］Machida H，Shinohara T，Iwahara Y，et al.Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes mimicking acute promyelocytic leukemia［J］.Int Med，2011，50(24):3037 －41.

［9］吳 菲，陳飛虎，洪凡青，等.ATPR對ECA-109、PANC-1、HeLa細胞增殖及分化的影響［J］.中國癌癥雜志，2012，22(4):257－63.

［9］Wu Fei，Chen F H，Hong F Q，et al.Effects of a new retinoic acid derivative ATPR on the proliferation and differentiation of ECA-109，PANC-1 and HeLa tumor cells［J］.China Oncol，2012，22(4):257－63.

［10］Jiang H N，Zeng B，Zhang Y，et al.Involvement of TRPC channels in lung cancer cell differentiation and the correlation analysis in human non-small cell lung cancer［J］.PLos One，2013，8(6):e67637.

［11］Yamada O，Ozaki K，Nakatake M，et al.Akt and PKC are involved not only in upregulation of telomerase activity but also in cell differentiation-related function via mTORC2 in leukemia cells［J］.Histochemistry And Cell Biol，2010，134(6):555 －63.

［12］王振義，陳 竺.腫瘤的誘導分化和凋亡療法［M］.上海:上海科學技術出版社，1999:142.

［12］Wang Z Y，Chen Z.Induced differentiation and apoptosis of tumor therapy［M］.Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，1999:142.

［13］Dawson H D，Collins G，Pyle R，et al.The retinoic acid receptoralpha mediates human T-cell activation and Th2 cytokine and chemokine production［J］.BMC Immunol，2008，9(16):1472 －85.

［14］Zhou T B，Qin Y H.The potential mechanism for the different expressions of gelatinases induced by all-trans retinoic acid in different cells［J］.J Recept Signal Transd，2012，32(3):129 － 33.

［15］Carnero A，Blanco-Aparicio C，Renner O，et al.The PTEN/PI3K/AKT signalling pathway in cancer，therapeutic implications［J］.Curr Cancer Drug Targ，2008，8(3):187－98.