左氧氟沙星經(jīng)胃轉(zhuǎn)運(yùn)、分布特點(diǎn)的研究

鮑峻峻，許建明，胡詠梅，梅 俏，石 海，鄭海倫，李見(jiàn)春

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.腔鏡中心、2.消化內(nèi)科，消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022;3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽蚌埠 233000;4.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蚌埠 233000)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱 H.pylori，Hp)現(xiàn)已證實(shí)是多種上消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的最重要致病因子，應(yīng)用抗菌藥物根除Hp具有十分重要的臨床意義［1］。從藥理學(xué)角度分析，抗菌藥物治療成功與否取決于感染部位藥物的濃度。由于Hp特異性定植于胃粘液及其下方黏膜表面［2］，因此，只有抗菌藥物在其定植部位濃度達(dá)到所需殺菌濃度方可起效。抗菌藥物胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)具有特殊的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，存在胃內(nèi)直接分布及腸道吸收后由血轉(zhuǎn)運(yùn)至胃組織的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其中抗菌藥物由血轉(zhuǎn)運(yùn)至胃致其胃內(nèi)局部濃度升高的決定性因素，從而成為殺滅Hp根除成功的關(guān)鍵［3］。

近年來(lái)Hp耐藥情況日益嚴(yán)重，經(jīng)典的三聯(lián)療法——質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPI)聯(lián)合抗菌藥物克拉霉素(clarithromycin)、阿莫西林(amoxicillin)或甲硝唑(metronidazole)根除失敗率逐年升高，根除率已低于或遠(yuǎn)低于80%，單純延長(zhǎng)經(jīng)典三聯(lián)療法的療程，根除率也僅提高5%［4］。因此，急需選擇新的一線替代治療方案或二線方案。其中，含有左氧氟沙星的方案是主要推薦方案之一。雖然左氧氟沙星已檢出耐藥株，部分地區(qū)耐藥率也較高［5］，但含左氧氟沙星的三聯(lián)方案根除率仍超過(guò)80%，我國(guó) 2012 年共識(shí)意見(jiàn)［1］、Maastricht IV［6］和美國(guó) College of Gastroenterology 指南［7］仍把含左氧氟沙星的三聯(lián)治療方案推薦作為一線替代方案或補(bǔ)救方案，并已逐漸廣泛應(yīng)用。但目前缺乏針對(duì)左氧氟沙星胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布特點(diǎn)的基礎(chǔ)研究，有必要對(duì)左氧氟沙星胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布特點(diǎn)進(jìn)行研究。

綜上所述，本課題擬在建立研究抗菌藥物胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，初步探討左氧氟沙星在大鼠胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布特點(diǎn)，從而為臨床應(yīng)用左氧氟沙星根除Hp過(guò)程中的藥代動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物試驗(yàn) 取清潔級(jí)Wistar大鼠80只(購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)，♂，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)進(jìn)行分組，每組各40只。試驗(yàn)為平行隨機(jī)試驗(yàn)，試驗(yàn)動(dòng)物按左氧氟沙星(左氧氟沙星原料藥純度＞99.9%，由北京雙鶴藥業(yè)股份公司提供)給藥劑量的不同分為左氧氟沙星50、100 mg·kg－1組 (分別模擬人體 500、1000 mg·d－1劑量)。

試驗(yàn)前24 h大鼠禁食、不限水。大鼠稱重后，按 3 ml·kg－1劑量給予 0.6 mol·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉，妥善固定后開(kāi)腹，于十二指腸距幽門2 cm處用電刀切開(kāi)，將一個(gè)橡膠軟管通過(guò)十二指腸切口經(jīng)幽門插入胃腔。用生理鹽水充分沖洗，直至吸出液中無(wú)殘?jiān)鼮橹埂ｋS后，大鼠根據(jù)劑量組不同，分別按50、100 mg·kg－1計(jì)算所需左氧氟沙星劑量，精確稱量所需左氧氟沙星后，溶于2 ml注射用生理鹽水，震蕩器30s待藥物充分溶解后，自大鼠外周靜脈勻速快速推注(推注時(shí)間為10～15 s)。隨后分別在15、30、45、60、75、90、105、120 min 時(shí)，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血處死動(dòng)物;立刻行食道和十二指腸結(jié)扎，迅速分離胃組織，用生理鹽水清洗外部后，完全收集胃液，自胃小彎處沿軸線方向剖開(kāi)胃組織，胃組織按前胃、腺胃(分為胃體和胃竇)采用水泡法［8］剝離胃黏膜組織。剝離的胃黏膜經(jīng)稱重后，進(jìn)行研磨勻漿，并按1∶9比例用生理鹽水稀釋。所有胃液和胃黏膜勻漿組織稀釋液樣本經(jīng)隱血試紙檢測(cè)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性樣本不予保留，弱陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性樣本保留。

血液樣本按各時(shí)間點(diǎn)收集后，經(jīng)5 000 r·min－1離心10 min，取血清 －80℃保存待用;胃液樣本按時(shí)間點(diǎn)收集后，精確計(jì)量體積，經(jīng)5 000 r·min－1離心10 min，取上清液 －80℃保存待用;胃黏膜勻漿稀釋液經(jīng)5 000 r·min－1離心10 min，取上清液－80℃保存待用。

1.2 HPLC 方法［9］

1.2.1 色譜條件 HPLC分析系統(tǒng)由Shimadzu LC-20AT高壓泵，SPD-20AV UV檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC溫控箱和Lcsolution分析系統(tǒng)組成。Kromosil C18柱配合C18保護(hù)預(yù)柱作為分析柱，柱溫維持50℃;流動(dòng)相［乙腈 －50 mmol·L－1檸檬酸 －1 mol·L－1醋酸銨 (19 ∶80 ∶1;V/V)］，流速為1.0 ml·min－1;分析所需波長(zhǎng)為295 nm，靈敏度為0.01aufs;進(jìn)樣體積為 20 μl，運(yùn)行時(shí)間為 6 min［10］。1.2.2 線性范圍 用空白大鼠血清、胃液和胃黏膜組織勻漿稀釋液將各樣本母液(1 g·L－1)稀釋配制1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg·L－1濃度范圍標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。質(zhì)控點(diǎn)樣本(QC)選擇3種生物樣本標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.0、10.0 和100.0 mg·L－1，用以驗(yàn)證本方法。

1.2.3 樣本處理方法 所有樣本均冷凍保存于－80℃。處理前，冷凍樣本在室溫狀態(tài)下解凍。①血清樣本。100 μl樣本置于試管中，加入等體積100 g·L－1三氯乙酸沉淀蛋白，渦旋 2 min，12 000 r·min－1速度離心 10 min，收集上清，取 20 μl用于分析。②胃液和胃黏膜組織樣本。100 μl樣本置于試管中，加入等體積甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，12 000 r·min－1速度離心 10 min，收集上清，取 20 μl用于分析。

1.2.4 HPLC方法驗(yàn)證 重點(diǎn)對(duì)HPLC方法的選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4.1 選擇性 為評(píng)價(jià)選擇性，選取大鼠/人血清、胃液、胃黏膜空白組織樣本各6份進(jìn)行檢測(cè)以確定空白樣本對(duì)藥物出峰信號(hào)無(wú)干擾。實(shí)驗(yàn)要求，空白組織對(duì)藥物出峰位置無(wú)內(nèi)源性干擾信號(hào)。

1.2.4.2 線性 將配制完成的大鼠血清、胃液、胃黏膜組織標(biāo)準(zhǔn)溶液用于HPLC檢測(cè)，藥物峰面積采用外標(biāo)法(external standard method)比較濃度并求出回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性程度采用相關(guān)系數(shù)(r)表示，一般r應(yīng)不小于0.99。每個(gè)濃度樣本檢測(cè)5次。

1.2.4.3 準(zhǔn)確度 采用相對(duì)回收率評(píng)價(jià)此HPLC

方法檢測(cè)大鼠血清、胃液、胃黏膜組織的準(zhǔn)確度，其計(jì)算方法是QC樣本按HPLC方法測(cè)定得出相應(yīng)峰面積，QC樣本每個(gè)濃度至少測(cè)定5份樣本，將測(cè)得峰面積代入回歸方程，求得的計(jì)算濃度，計(jì)算濃度除以理論濃度，即為相對(duì)回收率，要求所有回收率應(yīng)大于80%。

1.2.4.4 精密度 將低、中、高濃度的QC樣本在相同條件下在同一天檢測(cè)5次用來(lái)評(píng)價(jià)日內(nèi)(或批內(nèi))變異;在連續(xù)3天內(nèi)每天檢測(cè)2次用來(lái)評(píng)價(jià)日間(或批間)變異，評(píng)價(jià)指標(biāo)為RSDs(relative standard deviations)，要求各QC濃度點(diǎn)RSD不應(yīng)大于15%。

1.2.4.5 穩(wěn)定性 低、中、高濃度的QC樣本分別在室溫狀態(tài)下解凍后及保存2、4、6、8 h后進(jìn)行檢測(cè)，用來(lái)評(píng)價(jià)左氧氟沙星在室溫狀態(tài)下的穩(wěn)定性;另取樣本保存于－20℃ 1個(gè)月，每份標(biāo)本每周解凍檢測(cè)1次，用來(lái)評(píng)價(jià)藥物在－20℃狀態(tài)下的穩(wěn)定性。

1.2.4.6 靈敏度 在標(biāo)準(zhǔn)溶液最低濃度和空白樣本最大噪音值，LOD是基于信噪比(S/N:3)為3計(jì)算。LOQ則是基于信噪比為10計(jì)算。

1.3 藥代動(dòng)力學(xué)分析

1.3.1 大鼠不同部位左氧氟沙星藥代動(dòng)力學(xué)分析方法

1.3.1.1 大鼠中左氧氟沙星血濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)根據(jù)大鼠各實(shí)驗(yàn)組實(shí)測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度得出藥時(shí)曲線;計(jì)算并比較2種劑量組血漿藥物濃度－時(shí)間曲線下面積(AUC)，血清除率(CL)，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)，峰濃度(Cmax)。

1.3.1.2 左氧氟沙星在大鼠胃液、胃黏膜中濃度及分布和轉(zhuǎn)運(yùn) 根據(jù)不同劑量組各時(shí)間點(diǎn)的胃液和不同部位胃黏膜組織藥物濃度得出藥時(shí)曲線;分別比較不同劑量組各時(shí)間點(diǎn)胃液、胃黏膜組織藥物濃度。計(jì)算相應(yīng)的胃清除率和藥物胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分?jǐn)?shù)，所用計(jì)算公式為［11］:

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以大鼠血清中左氧氟沙星濃度采用DAS2.0軟件中非房室模型法計(jì)算PK參數(shù)。本課題所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在SPSS 14.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包中完成。2劑量組不同組織的藥物濃度及PK參數(shù)二組間比較選用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 左氧氟沙星血清、胃液及胃黏膜中HPLC測(cè)定結(jié)果 如Fig 1－3，大鼠血清、胃液和胃黏膜空白組織樣本對(duì)藥物出峰無(wú)內(nèi)源性干擾信號(hào)。大鼠血清、胃液和胃黏膜樣本中左氧氟沙星濃度與峰面積比的線性相關(guān)評(píng)價(jià)范圍均確定在1－100 mg·L－1，相關(guān)系數(shù)值均為r2=0.999，提示在各自濃度范圍內(nèi)檢測(cè)大鼠血清、胃液、胃黏膜內(nèi)左氧氟沙星濃度均顯示出良好的線性相關(guān)，其組織線性方程分別為=0.0000272X－0.310，=0.0000132X－0.099，=0.0000157X－0.110。此外，如Tab 1結(jié)果所示，準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、靈敏度均符合研究要求。建立HPLC方法后，對(duì)大鼠血清、胃液及不同部位胃黏膜組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)血清、胃液及胃黏膜組織的線性方程進(jìn)行計(jì)算，得出藥物濃度。

2.2 大鼠胃內(nèi)左氧氟沙星轉(zhuǎn)運(yùn)、分布特點(diǎn)

2.2.1 大鼠不同劑量左氧氟沙星胃內(nèi)分布濃度比較 如Tab 2所示，左氧氟沙星50、100 mg·kg－1劑量組各時(shí)間點(diǎn)各部位藥物濃度分布結(jié)果相類似。50 mg·kg－1劑量組自45 min時(shí)間點(diǎn)起，胃液左氧氟沙星濃度逐漸升高，高于血藥濃度(P＜0.05);100 mg·kg－1劑量自60 min開(kāi)始，胃液左氧氟沙星濃度逐漸升高，高于血藥濃度(P＜0.05)。

2劑量組均自15 min時(shí)間點(diǎn)起，胃體、胃竇左氧氟沙星濃度即高于血藥濃度及前胃左氧氟沙星濃度(P＜0.05);胃體和胃竇左氧氟沙星濃度差異無(wú)顯著性。而前胃左氧氟沙星濃度與血藥濃度相比，除15 min時(shí)間點(diǎn)外差異無(wú)顯著性。2劑量組間比較，胃液、前胃、胃體左氧氟沙星濃度自90 min時(shí)間點(diǎn)起開(kāi)始差異有顯著性(P＜0.05)，但胃竇左氧氟沙星濃度無(wú)差異(P＞0.05)。

Fig 1 Chromatogram of blank serum(A)，and blank serum added levofloxacin(B)of rats，the serum after levofloxacin administered to rats(C)

Fig 2 Chromatogram of blank gastric juice(A)，and blank gastric juice added levofloxacin(B)of rats，the gastric juice after levofloxacin administered to rats(C)

Fig 3 Chromatogram of blank gastric mucosa(A)，and blank gastric mucasa added levofloxacin(B)of rats，the gastric mucosa after levofloxacin administered to rats(C)

Tab 1 Accuracy，precision，stability and sensitivity of the HPLC method for the analysis of the levofloxacin in serum，gastric juice，gastric mucosa of rats

Tab 2 Concentration of levofloxacin of serum，gastric juice and all parts of stomach at doses of 50 mg·kg－1and 100 mg·kg－1in rats

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of levofloxacin after intravenous infusion in 2h at dose of 50 mg·kg－1，100 mg·kg－1in rats

左氧氟沙星50 mg·kg－1劑量組胃清除率為1.13 L·h－1·kg－1，轉(zhuǎn)運(yùn)分?jǐn)?shù)為 2.36;100mg·kg－1劑量組胃清除率為1.18 L·h－1·kg－1，轉(zhuǎn)運(yùn)分?jǐn)?shù)為2.52。

2.2.2 大鼠不同劑量左氧氟沙星胃內(nèi)各組織藥物濃度/血藥濃度%比較 50·kg－1組自30 min起，100 mg·kg－1組自45 min 起，胃液(藥物濃度/血藥濃度)%、胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%明顯高于前胃(藥物濃度/血藥濃度)%(P＜0.05);隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)，50 mg·kg－1組給藥后75 min起，100 mg·kg－1組自60 min起，胃液(藥物濃度/血藥濃度)%明顯高于胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%(P＜0.05);胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%，差異無(wú)顯著性。

而2劑量組的胃液(藥物濃度/血藥濃度)%、前胃(藥物濃度/血藥濃度)%、胃體(藥物濃度/血藥濃度)%、胃竇(藥物濃度/血藥濃度)%，差異無(wú)顯著性。

2.2.3 大鼠不同劑量左氧氟沙星藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

Tab 3列出左氧氟沙星 50、100 mg·kg－1組部分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。其中，所測(cè)時(shí)點(diǎn)中Cmax分別為33.17 mg·L－1、43.97 mg·L－1，Tmax均為 0.25 h。比較 2組AUC(0－2h)間差異有顯著性(P＜0.05);而2組血清除率及胃清除率差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

3 討論

本文結(jié)果顯示，在2 h取材時(shí)間內(nèi)，左氧氟沙星50、100 mg·kg－1劑量組胃液和胃各部位左氧氟沙星濃度總體趨勢(shì)大致相似，胃液、胃體、胃竇組織中藥物濃度與血藥濃度百分比在不同時(shí)點(diǎn)的數(shù)值為150%～600%，提示左氧氟沙星在胃液及胃內(nèi)組織易于集聚，轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)，但胃體和胃竇分布無(wú)差異。

在所選2 h取材時(shí)間內(nèi)，胃液左氧氟沙星濃度隨時(shí)間點(diǎn)呈上升趨勢(shì)，除前期幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)外，胃液左氧氟沙星濃度均明顯高于血藥濃度(增高比例為300%～500%)。據(jù)此，推測(cè)左氧氟沙星在胃內(nèi)可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。原因如下:克拉霉素作為目前公認(rèn)胃內(nèi)存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物，阿莫西林胃內(nèi)幾乎不轉(zhuǎn)運(yùn)，其轉(zhuǎn)運(yùn)分?jǐn)?shù)分別為2.28和0.15［12］，對(duì)比二者轉(zhuǎn)運(yùn)分?jǐn)?shù)，左氧氟沙星在胃內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)分?jǐn)?shù)為2.50左右，提示可能存在胃內(nèi)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn);另外，左氧氟沙星在腎臟和小腸內(nèi)均已證實(shí)存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。據(jù)此，推測(cè)左氧氟沙星胃內(nèi)可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，將進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)計(jì)算有關(guān)米氏方程及其米氏參數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)左氧氟沙星胃內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)類型。此外，結(jié)果顯示，大鼠胃內(nèi)左氧氟沙星分布存在差異，腺胃左氧氟沙星濃度明顯高于前胃左氧氟沙星濃度，但胃體和胃竇分布無(wú)明顯差異。由于人體胃內(nèi)并無(wú)前胃的結(jié)構(gòu)，因此，是否可以據(jù)此推斷人體胃內(nèi)分布存在差異，仍需下一步的人體試驗(yàn)加以證實(shí)。

本課題選擇實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2 h，可能無(wú)法完全模擬藥物在人體內(nèi)的作用，主要原因是配合下一步課題組即將進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)，由于胃黏膜組織體外試驗(yàn)一般多選擇2 h的試驗(yàn)時(shí)間，此外，試驗(yàn)的目的是研究左氧氟沙星胃內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布特點(diǎn)，故前期的體內(nèi)試驗(yàn)也同樣選擇2 h，并選擇相同的試驗(yàn)點(diǎn)。由于總體試驗(yàn)時(shí)間較短，對(duì)比50和100 mg·kg－1組，所有時(shí)間點(diǎn)胃液和各部位胃黏膜濃度均高于左氧氟沙星對(duì) Hp 的 MIC50(0.25 mg·L－1)［13］，因此，無(wú)法單純從藥物濃度與MIC值關(guān)系來(lái)比較兩劑量組的優(yōu)劣。此外，有文獻(xiàn)認(rèn)為，左氧氟沙星用于根除 Hp 250 mg，1天2次和500 mg，1天1次的療效基本相當(dāng);通過(guò)增加左氧氟沙星的劑量(如500 mg，1天2次)及療程并不增加療效，對(duì) Hp根除率并無(wú)增加［14］，加之 1 000 mg·d－1劑量的安全性在我國(guó)人群中尚無(wú)相關(guān)研究數(shù)據(jù)，故目前仍推薦使用500 mg·d－1劑量。驗(yàn)證兩劑量組的優(yōu)劣需延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)特別是比較12 h或24 h胃液或各部位胃黏膜左氧氟沙星濃度與MIC間的關(guān)系。

此外，臨床進(jìn)行Hp根除治療基本都是采用口服給藥，從口服藥物到最終起效，存在兩個(gè)起效階段，即胃內(nèi)直接分布以及腸道吸收后由血至胃組織的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布過(guò)程參與的環(huán)節(jié)眾多，影響其中任一環(huán)節(jié)的因素均可影響Hp根除效果。但無(wú)論如何，從血轉(zhuǎn)運(yùn)至胃是Hp根除成功的關(guān)鍵，加之口服抗菌藥物更易受其它因素干擾，故本課題采用靜脈給藥方式，將前期可能對(duì)研究結(jié)果造成影響的因素進(jìn)行排除，重點(diǎn)考察抗菌藥物由血轉(zhuǎn)運(yùn)至胃的情況及特點(diǎn)，另一方面胃液內(nèi)左氧氟沙星濃度高，推測(cè)左氧氟沙星同樣可通過(guò)局部直接作用對(duì)胃黏膜和胃粘液層內(nèi)定植的Hp起作用。至于左氧氟沙星口服胃內(nèi)直接分布特點(diǎn)，將在今后的研究中進(jìn)一步考察。

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