右美托咪定預防嗎啡耐受及其對脊髓內膠質細胞和ERK的影響

周 寧，陳春龍，高 珊，高獻忠，劉清珍，劉 健，嵇 晴，李偉彥

(1.徐州醫學院麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221002;2.南京軍區南京總醫院麻醉科，江蘇南京 210002)

嗎啡和其他阿片類鎮痛藥因其耐受和依賴等副作用而嚴重影響了其在臨床上的使用。近來的研究發現，脊髓膠質細胞的活化在嗎啡耐受的發生和維持中發揮重要作用［1－3］。強效、高選擇性的α2受體激動劑右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)在急性炎性痛、術后痛乃至神經病理性疼痛中都具有一定的鎮痛作用，且有研究發現它能明顯抑制坐骨神經結扎大鼠脊髓背角星形膠質細胞的肥大和ERK信號通路的活化［4］，但其對嗎啡耐受的影響尚不清楚。本研究觀察預先給予右美托咪定對正常大鼠嗎啡耐受的作用及其對脊髓星形膠質細胞活化和ERK磷酸化的影響，探討右美托咪定在多模式鎮痛及防治阿片耐受中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 ♂ SD大鼠48只(南京軍區南京總醫院比較醫學科提供)，體質量180～220 g，隨機分成6組，每組8只。Ⅰ組空白對照組;Ⅱ組嗎啡(批號:120714-2，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)耐受組;Ⅲ組 50 μg·kg－1右美托咪定對照組;Ⅳ 組 12.5 μg· kg－1右 美 托 咪 定 (批 號:12100534，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)處理組;Ⅴ組 25 μg·kg－1右美托咪定處理組;Ⅵ組 50 μg·kg－1右美托咪定處理組。

1.2 給藥方案 參照Raghavendra等［2］方法建立嗎啡耐受模型，即每天8∶00和17∶00皮下注射嗎啡10 mg·kg－1，連續5 d;Ⅰ組和Ⅲ組皮下分別注射等量生理鹽水和右美托咪定;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組在早上注射嗎啡前30 min皮下注射相應劑量的右美托咪定。

1.3 行為學測試 d 1、d 7，參照 Bianchi等［5］方法測定各組大鼠熱縮足潛伏期(PWTL)。每只大鼠重復測定5次，最長照射時間為20 s以防組織損傷，刪除最大和最小值，取平均值作為大鼠的基礎潛伏期。測定基礎PWL后，皮下注射嗎啡10 mg·kg－1后30 min測定每組大鼠的PWL，取其平均值作為鎮痛閾值并計算最大鎮痛效應百分比(%MPE)，即%MPE=(鎮痛閾值－基礎潛伏期)/(最長照射時間－基礎潛伏期)×100%。

1.4 標本收集 d 7，測試完各組大鼠行為學后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 g·kg－1，其中4只留取腰膨大用于ERK和p-ERK含量的測定。另外4只經左心室灌注4%多聚甲醛，留取腰膨大保存于4%多聚甲醛中，放于4℃冰箱保存，用于免疫組織化學檢測。

1.5 免疫印跡法(Western blot) 取腰膨大，組織勻漿，以15 000 r·min－1離心5 min后取上清液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，定量后加入相應體積的Loading buffer和PBS緩沖液煮沸5 min使其變性。經SDS凝膠電泳，轉至經甲醛激活的PVDF膜，室溫下在5%脫脂牛奶中封閉1 h，兔抗大鼠ERK和p-ERK一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)4℃孵育過夜。d 2，5%脫脂牛奶洗5 min×3次，TBST洗5 min×3次，間隔洗，羊抗兔二抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)室溫孵育 1 h，5% 脫脂牛奶洗5 min×3次，TBST洗5 min×3次，間隔洗，暗室內增強型化學發光試劑(ECL)顯色曝光，內參為 GAPDH(1 ∶1 000，Cell Signaling Technology)。應用UN-SCAN-IT gel軟件分析免疫印跡條帶。

1.6 免疫組織化學染色 取腰膨大，置于4%多聚甲醛中固定24 h，蔗糖脫水沉底，行冰凍冠狀切片，厚約15μm。按標準免疫組化染色SP法進行。一抗采用多克隆兔抗大鼠GFAP(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)，濕盒4℃孵育36～48 h，生物素標記的羊抗大鼠IgG，37℃孵育1 h，辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育1 h，DAB 顯色、貼片、脫水、透明、封片。光鏡下觀察，攝片。

1.7 統計學分析 采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析，計量數據采用±s表示，兩兩組間比較采用LSD檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 行為學測試 d 1，6組大鼠之間基礎熱痛閾和MPE值差異無統計學意義。d 7，各組大鼠在皮下注射嗎啡前基礎PWL無差異(Tab 1)。皮下注射10 mg·kg－1嗎啡30 min后，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅳ組大鼠的MPE值明顯降低。與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ組大鼠的MPE值均升高(P＜0.05)，但Ⅳ組差異比較無統計學意義(Fig 1)。

Tab 1 PWL of each group before subcutaneous injection of morphine(±s，n=8)

Tab 1 PWL of each group before subcutaneous injection of morphine(±s，n=8)

Group Basic PWL/s d 1 d 7Ⅰ9.97 ±1.54 9.94 ±1.54Ⅱ9.83 ±0.74 9.85 ±0.73Ⅲ9.22 ±0.70 9.23 ±0.70Ⅳ9.91 ±1.60 9.87 ±1.59Ⅴ10.59 ±1.03 10.56 ±1.03Ⅵ10.11 ±0.89 10.05 ±0.88

Fig 1 %MPE at 30min of rats on day 1 and day 7

2.2 ERK和p-ERK的表達 各組大鼠腰5脊髓內總ERK的表達無明顯差異。與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅳ組腰5脊髓內p-ERK表達量明顯升高;與Ⅱ組相比，Ⅴ、Ⅳ組腰5脊髓內p-ERK表達量明顯降低(P＜0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Expression of ERK and p-ERK in L5 spinal cord

2.3 GFAP的表達 免疫組織化學結果顯示，Ⅰ組和Ⅲ組大鼠腰5脊髓背角僅有少量的GFAP表達，而Ⅱ組大鼠腰5脊髓背角GFAP表達量明顯增多。與Ⅱ組相比，皮下50 μg·kg－1右美托咪定處理組即Ⅵ組大鼠腰5脊髓背角GFAP表達量明顯減少(Fig 3)。

3 討論

嗎啡是一種強效的止痛劑，然而反復使用卻會形成耐受狀態，其確切的病理機制仍然不是很清楚。近年來脊髓膠質細胞活化在嗎啡耐受發生和維持中的作用逐漸被認識。2001年Song等［1］首次報道腹腔連續注射嗎啡可導致明顯的嗎啡耐受，同時引起大鼠脊髓、后扣帶回皮層以及海馬的星形膠質細胞明顯肥大;鞘內給予非特異性膠質細胞抑制劑——氟枸櫞酸，能明顯緩解嗎啡鎮痛作用的耐受以及星形膠質細胞標志物角質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫活性的增強。抑制膠質細胞的活性已經被證實能減弱嗎啡耐受的形成［6］。給予膠質細胞抑制劑丙戊茶堿能明顯抑制膠質細胞的活性，緩解嗎啡耐受［7］。此后大量的報道證明多種非特異性膠質細胞抑制劑如:己酮可可堿［8］、米諾環素［9］等能明顯緩解嗎啡耐受。這些研究均提示了通過調控膠質細胞，特別是星形膠質細胞的活性可以有效的預防嗎啡耐受的形成和發展。

研究發現，嗎啡能引起 ERK的磷酸化［10］。鞘內注射ERK抑制劑能減弱神經損傷引起的痛覺過敏［11］。大鼠鞘內連續注射嗎啡7 d后脊髓星形膠質細胞中磷酸化的ERK明顯增多，而抑制星形膠質細胞中ERK通路的激活能夠緩解嗎啡耐受［12－13］。磷酸化的ERK能激活膠質細胞，刺激炎性分子的產生和釋放并放大疼痛信號［14］。Liu等［4］研究發現注射DEX能明顯抑制坐骨神經結扎大鼠脊髓背角星形膠質細胞的肥大和ERK信號通路的活化。DEX腹膜內注射，從炎癥早期開始，明顯抑制單關節炎誘導的熱痛覺過敏和脊髓膠質細胞的活化，特別是星形膠質細胞［15］。因此我們認為DEX可能具有預防嗎啡耐受的作用。

由于DEX的高脂溶性，全身注射后能快速通過血腦屏障激活中樞神經系統的α2受體，所以在本實驗中選擇皮下注射。皮下注射更容易操作，但很明顯，和鞘內給藥相比會需要更大劑量。在本實驗中觀察到在高劑量DEX作用下，大鼠出現嗜睡現象，但24 h后對老鼠活動未見明顯影響。因為DEX的半衰期大約是2 h，所以本實驗中DEX的注射時間是每天7∶30，而行為學測試時間為d 7為8∶00以盡量減少DEX本身的鎮靜和鎮痛影響。

Fig 3 Expression of GFAP in dorsal horn of spinal cord

在嗎啡耐受過程中，降鈣素基因相關肽(CGRP)水平升高，而阻斷CGRP受體能減弱嗎啡耐受的形成［13］。α2受體的活化能減少CGRP、興奮性氨基酸的釋放，它們與嗎啡耐受的形成密切相關。DEX可能通過減少這些物質的釋放從而抑制了星形膠質細胞的活化。和我們的結果相反，Peng等［16］的研究表明用50 nmol·L－1DEX處理體外培養的膠質細胞能增加ERK的表達，而高濃度的DEX對ERK的表達沒有影響。ERK是多種刺激觸發的共同信號通路，它的角色是廣泛和復雜的，其活化的程度，表達的位置，ERK表達的結果會隨著刺激的不同而改變［17］。胞內 Ca2+離子濃度的升高和NMDARs的活化對ERK的活化非常重要。Zheng等［18］證實 DEX能抑制脊髓內 NMDARs的活化。DEX對p-ERK抑制作用的機制仍不是很清楚，可能通過抑制NMDARs活化或激活神經元和膠質細胞膜上的α2受體從而影響胞內Ca2+濃度進而影響了p-ERK的表達從而抑制了星形膠質細胞的活化。但是具體的機制還需要進一步的研究。

綜上所述，DEX能預防正常大鼠嗎啡耐受的形成且與劑量有關，這可能與其有效地抑制了脊髓內ERK的磷酸化及星形膠質細胞的活化有關。本研究結果為臨床上降低單一用藥的劑量和不良反應，提高對藥物的耐受性，加快起效時間，延長鎮痛時間等提供新選擇。

［1］Song P，Zhao Z Q.The involvement of glial cells in the development of morphine tolerance［J］.Neurosci Res，2001，39(3):281－6.

［2］Raghavendra V，Rutkowski M D，DeLeo J A.The role of spinal neuroimmune activation in morphine tolerance/hyperalgesia in neuropathic and sham-operated rats［J］.J Neurosci，2002，22(22):9980－9.

［3］李永樂 ，謝軍明 ，舒銀銀，等.瑞舒伐他汀部分恢復嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮痛效能［J］.中國藥理學通報，2013，29(1):64－8.

［3］Li Y L，Xie J M，Shu Y Y，et al.Rosuvastatin partially restored the analgesic effect of morphine in rats with morphine tolerance［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(1):64 －8.

［4］Liu L，Ji F，Liang J，et al.Inhibition by dexmedetomidine of the activation of spinal dorsal horn glias and the intracellular ERK signaling pathway induced by nerve injury［J］.Brain Res，2012，1427:1－9.

［5］Bianchi M，Sacerdote P，Ricciardi-Castagnoli P，et al.Central effects of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 alpha on nociceptive thresholds and spontaneous locomotor activity［J］.Neurosci Lett，1992，148(1-2):76 －80.

［6］Hutchinson M R，Bland S T，Johnson K W，et al.Opioid-induced glial activation:mechanisms of activation and implications for opioid analgesia，dependence，and reward［J］.Scientific World J，2007，7:98－111.

［7］Raghavendra V，Tanga F Y，DeLeo J A.Attenuation of morphine tolerance，withdrawal-induced hyperalgesia，and associated spinal inflammatory immune responses by propentofylline in rats.［J］.Neuropsychopharmacology，2004，29(2):327 －34.

［8］Mika J，Wawrzczak-Bargiela A，Osikowicz M，et al.Attenuation of morphine tolerance by minocycline and pentoxifylline in naive and neuropathic mice［J］.Brain Behav Immun，2009，23(1):75 －84.

［9］Cui Y，Liao X，Liu W，et al.A novel role of minocycline:attenuating morphine antinociceptive tolerance by inhibition of p38 MAPK in the activated spinal microglia［J］.Brain Behav Immun，2008，22(1):114－23.

［10］Bilecki W，Zapart G，Ligza A，et al.Regulation of the extracellular signal-regulated kinases following acute and chronic opioid treatment［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62(19-20):2369 － 75.

［11］Zhuang Z Y，Gerner P，Woolf C J，et al.ERK is sequentially activated in neurons，microglia，and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model［J］.Pain，2005，114(1):149 －59.

［12］Wang Z，Ma W，Chabot J，et al.Cell-type specific activation of p38 and ERK mediates calcitonin gene-related peptide involvement in tolerance to morphine-induced analgesia［J］.FASEB J，2009，23(8):2576－86.

［13］Wang Z，Ma W，Chabot J，et al.Morphological evidence for the involvement of microglial p38 activation in CGRP-associated development of morphine antinociceptive tolerance［J］.Peptides，2010，31(12):2179－84.

［14］Falsig J，P rzgen P，Lotharius J，et al.Specific modulation of astrocyte inflammation by inhibition of mixed lineage kinases with CEP-1347［J］.J Immunol，2004，173(4):2762 －70.

［15］Xu B，Zhang W S，Yang J L，et al.Dexmedetomidine blocks thermal hyperalgesia and spinal glial activation in rat model of monoarthritis［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(5):523 － 30.

［16］Peng L，Yu A，Fung K Y，et al.α-adrenergic stimulation of ERK phosphorylation in astrocytes is α ＜ sub＞ 2-specific and may be mediated by transactivation［J］.Brain Res，2003，978(1-2):65－71.

［17］Ji R R，Gereau R W，Malcangio M，et al.MAP kinase and pain［J］.Brain Res Rev，2009，60(1):135 －48.

［18］Zheng Y，Cui S，Liu Y，et al.Dexmedetomidine prevents remifentanil-induced postoperative hyperalgesia and decreases spinal tyrosine phosphorylation of N-methyl-d-aspartate receptor 2B subunit［J］.Brain Res Bull，2012，87(4):427 －31.