廣西眼鏡蛇毒蛋白Natrin在體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡作用的研究

宋 慧，徐星新，李映新，李雪華，蘇延旭，蔣興明，梁永紅

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021)

蛇毒是由毒蛇分泌的一種毒液，是具有酶活性和多種生物活性的蛋白質(zhì)和多肽的混合物［1］。廣西眼鏡蛇毒蛋白Natrin是從廣西眼鏡蛇毒中提取出的分子質(zhì)量為25 ku左右的單鏈多肽［2］，是CRISPs家族的新成員，是精制而成的單一成分的生物制劑，具有多種潛在活性，具有研究價(jià)值。目前已有報(bào)道，Natrin有抗脂質(zhì)過氧化、作用于離子通道等藥理作用［3-5］，但其抗腫瘤作用的研究尚鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株為模型，采用MTT方法、流式細(xì)胞技術(shù)和熒光顯微檢測技術(shù)與電子顯微鏡觀察Natrin對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，旨在為肝癌的臨床藥物治療提供新的研究方向和理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物 Natrin，廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所分離純化，提供凍干粉;陽性藥順鉑。給藥前均用改良型RPMI 1640培養(yǎng)基溶解。

1.2 主要試劑 改良型RPMI 1640培養(yǎng)基(Thermo);四氮噻唑藍(lán)，DMSO，青、鏈霉素混合液(100×)(Solarbio);Normal/Apoptotic/Necrotic Cell Detection Kit(凱基生物);0.25%胰酶溶液(吉諾生物);Cell Cycle Staining Kit(聯(lián)科生物)。

1.3 儀器 CKX-41倒置熒光顯微鏡，OLYMPUS Japan;MULTISKAN MK3酶聯(lián)免疫檢測儀，Thermo;透射電子顯微鏡，日立H-7650;流式細(xì)胞分析儀，美國BECKMAN COULTER公司。

1.4 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。細(xì)胞在含10%胎牛血清、青霉素1×105U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度為5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由0.25%的胰酶消化。

2 方法

2.1 MTT法檢測Natrin對(duì) SMMC-7721細(xì)胞增殖活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔8×103cells接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，棄上清液，分別加入不同濃度的Natrin液100 μl，終濃度分別為12.5、25、50、75、100、150、200、250、300、350 mg·L-1。陰性對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入等體積的10 mg·L-1的順鉑液。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，按MTT法，用酶標(biāo)儀在492 nm波長下測定各孔 OD值，計(jì)算抑制率。抑制率/%=(A對(duì)照組-A藥物組)/A對(duì)照組×100%。

2.2 AO/EB雙染色法檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔3.0×105cells接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的Natrin液2 ml，終濃度分別為 25、50、100、150 mg·L-1。陰性對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入等體積的5 mg·L-1的順鉑液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按試劑盒操作步驟在一潔凈的載玻片上染色，蓋上蓋玻片，倒置熒光顯微鏡510 nm激發(fā)波長下觀察并拍照。

2.3 透射電子顯微鏡法觀察凋亡形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按每瓶7.2×105cells接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為25、50 mg·L-1的Natrin液3 ml，正常對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出細(xì)胞消化，離心，棄上清，PBS洗滌2次，3%戊二醛固定2 h以上，0.1 mol·L-1PBS洗滌3次，1%鋨酸固定2 h，0.1 mol·L-1PBS洗滌3次，梯度濃度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618浸透包埋，徠卡UC7超薄切片機(jī)超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡百分?jǐn)?shù)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔3.0×105cells接種于6孔板。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的Natrin 液 2 ml，終濃度分別為 5、10、20、40 mg·L-1。陰性對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入等體積的5 mg·L-1的順鉑液，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌1～2次，消化，收集細(xì)胞，常溫800 r·min-1離心8 min。棄上清液，PBS洗滌2次，常溫800 r·min-1離心10 min。吸干上清液，加入500 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，加入Annexin V 和PI染料各5 μl，避光染色15、30 min 內(nèi)上流式分析儀測定。

2.5 細(xì)胞周期檢測 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔

2.0 ×105cells細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的Natrin液2 ml，終濃度分別為25、50、100、150 mg·L-1，空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，消化，收集細(xì)胞懸液，室溫800 r·min-1離心5 min，重復(fù)1遍。棄上清液，加1 ml PI和10 μl增透劑，渦旋混合5～10 s，室溫避光孵育30 min，上流式儀檢測。

3 結(jié)果

3.1 Natrin對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞存活率的影響 MTT法結(jié)果顯示，不同濃度的 Natrin對(duì)SMMC-7721細(xì)胞均有生長抑制作用，并且隨給藥濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)，最低抑制率為4.55%，最高抑制率為93.53%，經(jīng)SPSS 16.0 Probit法計(jì)算，24 h 的 IC50為 138.69 mg·L-1，見 Tab 1。

Tab 1 Growth inhibition ratio Results of SMMC-7721 cellsafter exposure to different concentrations of Natrin for 24h(±s)

Tab 1 Growth inhibition ratio Results of SMMC-7721 cellsafter exposure to different concentrations of Natrin for 24h(±s)

＊＊P＜0.01 vs negative control group.

Group Dose/mg·L-1 Absorbance value(A)Inhibitory rate/%Negative control 0.8452±0.047 -Cisplatin 10 0.0925±0.012＊＊ 89.06±0.014＊＊Natrin 12.5 0.8068±0.026 4.55±0.031 25 0.7925±0.012 6.24±0.015 50 0.7215±0.036＊＊ 14.64±0.043＊＊75 0.5940±0.041＊＊ 29.72±0.049＊＊100 0.5238±0.046＊＊ 38.04±0.055＊＊150 0.3642±0.104＊＊ 56.91±0.123＊＊200 0.2832±0.095＊＊ 66.49±0.112＊＊250 0.2415±0.052＊＊ 71.43±0.062＊＊300 0.1866±0.043＊＊ 77.93±0.051＊＊350 0.0547±0.034＊＊ 93.53±0.040＊＊

3.2 AO/EB雙染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 樣本經(jīng)AO/EB雙染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)呈均勻的綠色熒光，為正常活細(xì)胞(Fig 1-a)，而各加藥組有大量的核質(zhì)體呈致密濃染或有片段狀的、著不均勻綠色熒光的早期凋亡細(xì)胞以及核質(zhì)體著橙色并致密濃縮或呈碎片的晚期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)(Fig 1-b，c，d，e，f)。

Fig 1 Main apoptosis features of SMMC-7721 cells detected by AO/EB staining after treated with Natrin for 24 h(×400)

3.3 透射電鏡法觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài) 在透射電鏡下可觀察到對(duì)照組細(xì)胞無明顯凋亡形態(tài)，核膜與細(xì)胞膜完整，線粒體等細(xì)胞器清晰可見，核染色質(zhì)分布均勻，無固縮、邊集現(xiàn)象(Fig 2-a，b)。而Natrin藥物組則出現(xiàn)了一系列凋亡形態(tài)，細(xì)胞表面微絨毛脫落減少，核染色質(zhì)固縮成數(shù)個(gè)大小不等的塊狀，有些邊集，有些分散在核的中部，核膜褶皺，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器正常，分布相對(duì)集中，有時(shí)胞質(zhì)中可見空泡(Fig 2-c，d，e，f)。

Fig 2 Main apoptosis features of SMMC-7721 cells detected by transmission electron microscope after treated with Natrin for 24 h

3.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù) 流式結(jié)果顯示，各組早期凋亡百分?jǐn)?shù)與陰性對(duì)照組比較，其差異除5 mg·L-1組外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各組晚期凋亡百分?jǐn)?shù)與陰性對(duì)照組比較，其差異除10 mg·L-1組外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著劑量的增加總凋亡百分?jǐn)?shù)增加，各組與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見 Tab 2。

Tab 2 Effects on apoptosis rate of human hepatocarcinoma smmc-7721 cells after treated with different concentrations of Natrin(±s)

Tab 2 Effects on apoptosis rate of human hepatocarcinoma smmc-7721 cells after treated with different concentrations of Natrin(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control group.

Group Total/%Negative control 3.57±0.24 4.29±0.73 7.86±0 Dose/mg·L-1 Early apoptotic rate/%Late apoptotic rate/%.97 Cisplabin 5 22.47±1.81＊＊ 11.51±0.22＊＊ 33.98±2.03＊＊Natrin 5 4.42±0.42 6.86±1.21* 11.28±1.63*10 6.66±0.81＊＊ 5.57±1.84 12.23±2.65＊＊20 9.53±0.54＊＊ 7.91±1.24＊＊ 17.44±1.78＊＊40 14.58±0.93＊＊ 15.67±1.81＊＊ 30.25±2.74＊＊

3.5 Natrin對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響 用流式細(xì)胞儀檢測各期細(xì)胞比例，結(jié)果顯示隨著Natrin濃度的增大，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸減少，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸增大。除最低劑量組25 mg·L-1以外，各組與對(duì)照組比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見Tab 3。

Tab 3 Cell cycle Results of SMMC-7721 cells after treated with different concentrations of Natrin for 24h(±s)

Tab 3 Cell cycle Results of SMMC-7721 cells after treated with different concentrations of Natrin for 24h(±s)

*P＜0.05;＊＊P＜0.01 vs normal control group.

Group Cell proportion of each phase/%G0/G1 S G2/M Normal control 81.7±4.7 8.1±2.3 9.5±2.1 Natrin 25 mg·L-1 78.1±0.7 9.6±0.3 10.9±0.6 50 mg·L-1 75.6±1.6＊＊ 10.3±0.4* 12.7±1.2*100 mg·L-1 70.4±0.9＊＊ 11.7±0.3＊＊ 16.1±0.9＊＊150 mg·L-1 62.5±2.0＊＊ 15.8±1.1＊＊ 19.5±2.1＊＊

4 討論

肝癌是廣西乃至全國最常見的惡性腫瘤之一，近年來病死率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)于晚期肝癌，更是缺少有效的藥物治療方案［6］。近年來科學(xué)家們?cè)趶V西眼鏡蛇毒里面發(fā)現(xiàn)了一種新的單鏈多肽Natrin，它同樣屬于CRISPs家族，提示其很可能像其它CRISPs家族成員一樣具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在癌癥的治療中具有重要作用，是許多藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制之一［7-8］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了不同濃度的Natrin，使其作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h，通過MTT法檢測其對(duì)生長活力的影響。結(jié)果顯示，IC50為138.69 mg·L-1，與陰性對(duì)照組比較，各濃度組均能抑制SMMC-7721細(xì)胞生長，并且隨濃度的增大抑制作用增強(qiáng)，其發(fā)揮抑制作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。AO/EB雙染色法結(jié)果與電鏡結(jié)果顯示，給予Natrin后，SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生了染色質(zhì)邊集、濃縮、不均勻染色等明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，證明Natrin確實(shí)能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。流式結(jié)果顯示，被Natrin作用后，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)隨濃度的增大而增加，各藥物組凋亡百分?jǐn)?shù)與陰性對(duì)照組比較差異均有顯著性，這與MTT結(jié)果一致。

腫瘤是一類與細(xì)胞周期有關(guān)的疾病，細(xì)胞周期調(diào)控異常與細(xì)胞癌變密切相關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，Natrin對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的周期進(jìn)程產(chǎn)生明顯的影響。隨著Natrin濃度的升高，S期與G2/M期的細(xì)胞比例逐漸升高，而G0/G1期的細(xì)胞比例則逐漸下降，提示通過引起S期與G2/M期阻滯可能是Natrin誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，Natrin在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721有生長抑制作用并能有效地誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，通過對(duì)Natrin更深入的研究，有望得到一類新的抗肝癌藥物。至于Natrin是否能誘導(dǎo)其它類型腫瘤細(xì)胞凋亡，及其誘導(dǎo)凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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