一株抗鉛細菌的篩選及鑒定

冀偉，劉瑞，常亮，于源華

（1.長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022；2.長春醫學高等專科學校，長春 130013）

根據中國農業部的調查報告顯示，全國已經發現被重金屬污染的污水灌區占總體面積的64.8%以上［1］。每年的全國糧食總產量由于耕種用的土地受到重金屬的污染而導致經濟損失高達200億元，相當于每年4000多萬人失去基本生存用糧［2］。因此，對重金屬污染的檢測與治理刻不容緩。鉛作為重金屬中的一員，是被記載最多的有毒物質之一。城市環境鉛污染主要來源于汽油燃燒產生的廢氣，含鉛涂料，采礦、冶煉、鑄造等工業生產活動，食品和水的鉛污染，以及含鉛殺蟲劑、污泥施用于農業土壤等［3，4］。通過空氣、飲水、食物進入生物體的鉛會不斷積累，超過一定量時便會引起各種疾病。處理重金屬污染的傳統方法多為物理化學法，如化學沉淀法、離子交換法、反滲透法等，存在投資大、能耗高、操作困難、易產生二次污染等缺點［5］。隨著微生物學的發展，人們發明了具有操作簡單、投資少、污染小、專一性強等諸多優點的生物修復技術，在去除環境重金屬方面具有廣闊的應用前景。一般情況下，在受重金屬污染的地區都可篩選到抗重金屬的微生物，這些抗性微生物有潛在的重金屬吸附作用。因此，用重金屬選擇培養基，從中篩選出對土壤重金屬具有專性高效富集作用的菌株，并進行分類鑒定，是微生物修復技術應用的前提［6］。

隨著微生物學的進步與發展，人們發現像肺炎克雷伯氏菌［7］、浮游球衣菌［8］、Norcardia-amarae［9］、Phanerochaete chrysosportum［10］、Enterobacter sp.J1［11］、芽孢桿菌［12］、短小芽胞桿菌［13］、啤酒酵母菌［14］、拉微球菌［15］、鐮刀霉菌屬［15］、曲霉［16］、根霉［17］、靑霉［18］等微生物都具有一定的抗鉛能力，但耐受能力普遍較低，大都小于400mg/L。本實驗旨在尋找一種能抗高濃度鉛離子的微生物，并對其生物學特征進行研究，將其鑒別并分類，為鉛污染的檢測與治理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品取自長春市綠園區電鍍廠附近的土壤。

1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10gl/L，酵母浸粉5gl/L，NaCl，10gl/L。

固體LB培養基：胰蛋白胨10gl/L，酵母浸粉5gl/L，NaCl 10gl/L，瓊脂粉15g/L。

選擇培養基：LB培養基中分別加入Pb（NO3）2，使其終濃度分別為200mg/mL，300mg/mL，400mg/mL，500mg/mL，600mg/mL直至2000mg/mL。

1.3 菌株的篩選

稱取1g電鍍廠附近的土樣制成不同稀釋度的土壤稀釋液；吸取200μL土壤稀釋液，分別涂布在含有 100mg/mL Pb（NO3）2的固體 LB 平板上，靜置15min，將平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養48h；根據菌落不同形態，挑取平板上的單菌落到5mL含有100mg/mL Pb（NO3）2的液體LB培養基中，37℃，180rpm/min，振搖培養13h；將獲得的菌懸液反復涂布平板培養，直至革蘭氏染色鏡檢為單一菌落，接種于液體LB液體培養基中，37℃，180rpm/min，振搖培養12～14h。

取培養后的菌懸液500μL接種到5mL含有100mg/mL Pb（NO3）2的液體LB培養基中，37℃，180rpm/min，振搖培養13h后，再將培養后的菌懸液接種至含有200mg/mL的Pb（NO3）2液體LB培養基中，相同條件培養；以此類推，至Pb（NO3）2的終濃度為 2000mg/mL，最終獲得適應高濃度Pb（NO3）2的菌種，命名為FP 2000進行保存菌種。

1.4 革蘭氏染色鑒定

用革蘭氏染色法對FP2000菌進行革蘭氏染色，鏡檢觀察微生物形態。

1.5 生長曲線測定

取FP2000菌懸液100μL，接種在10mL液體LB培養基中，37℃恒溫條件下，180rpm/min振搖培養13h；取250μL的菌懸液分別接種到16支相同并編號的裝有5mL LB液體培養基的試管中，37℃，180rpm/min，振搖培養；分別于time（h）=0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5時取出一管，測定不同時間菌懸液的OD595值，繪制其生長曲線。并以培養時間為橫軸，OD595值為縱軸作圖。

1.6 最適生長溫度測定

將活化后的菌懸液按1∶50的比例分別接種于5ml液體LB培養基的試管中，分別于27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃條件下，180rpm/min，振搖培養5h后取出菌懸液，分別測定菌懸液OD595值，并繪制出FP 2000的最適生長溫度曲線。

1.7 最適生長pH值測定

配制pH值分別為5，6，7，8，9的LB液體培養基，取250μL菌懸液接種于5mL的LB培養基中，37℃，180rpm/min，振搖培養5h后，分別測定菌懸液OD595值，并繪制出FP 2000的最適pH值曲線。

1.8 對Pb2+等有毒重金屬離子的耐受性測定

為了探究FP 2000的對其他重金屬的抵抗能力，本實驗用FP 2000對Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+，Cu2+重金屬的敏感性進行了測試。分別配制含有終濃度為100mg/mL，500mg/mL，1000mg/mL和2000mg/mL的Pb2+，Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+，Cu2+的LB液體培養基，將活化的菌懸液和對照組普通BL 21大腸桿菌按1：50的比例接種于5mL LB培養基中，37℃，180rpm/min，振搖培養5h后，分別測定菌懸液吸光度OD595的數值，并繪制出在不同濃度下，FP 2000的對不同金屬的耐受性。

1.9 16S rDNA分析

16S rDNA的PCR擴增：提取FP 2000菌的基因組DNA，以細菌的總DNA為模板，克隆引物采用上海生工公司16S rDNA通用引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’和 27F：5’-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3’，進行PCR擴增。PCR的反應體系（50μL）：DNA模板1μL，10×Taq reaction Buffer 5μL，正向引物8F和反向引物1492各1μL，Taq酶0.25μL，dNTP 1μL，擴增程序為：98℃預變5min，95℃變性35s，55℃復性35s，72℃延伸90s，循環3次，最后72℃延伸8min（16S rDNA序列的測定由上海生工生物技術有限公司完成）。根據測序得出的結果進行系統進化樹分析，對FP 2000菌進行鑒定。

2 實驗結果與討論

2.1 FP 2000的分離、篩選和鑒定

對篩選的FP 2000進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察。觀察到結果為FP 2000染色后呈短棒狀紅色細菌（見圖1），因此判定該菌為革蘭氏陰性菌。

圖1 FP 2000菌革蘭氏染色40x鏡檢結果

2.2 菌生長條件的測定

2.2.1 生長曲線

以FP 2000的生長時間為橫坐標，吸光度OD595的值為縱坐標，并繪制生長曲線，如圖2。從生長曲線來看，FP 2000在3～7h達到對數生長期，7～9h，細菌生長達到遲緩期，9h以后為衰亡期。

圖2 FP2000菌的生長曲線

2.2.2 最適生長溫度

以細菌生長溫度為橫坐標，吸光度OD595的值為縱坐標，繪制FP 2000菌的最適生長溫度曲線，如圖3所示，可以看出FP 2000菌的最適溫度為34℃～40℃。

圖3 FP 2000菌的最適生長溫度

2.2.3 最適生長pH值

以不同pH值為橫坐標，吸光度OD595的值為縱坐標，并繪制FP 2000菌的最適pH生長曲線，如圖4，從圖中可以看出該菌株的最適生長pH為4.5-6，當pH值大于7時，生長速度迅速下降。原因是鉛需要在酸性條件下才能以鉛離子形態存在，因此抗鉛離子的菌株也能適應酸性生長條件。

圖4 FP 2000菌的最適生長pH值

2.2.4 不同重金屬的耐受性

圖5表示出了FP 2000的抗鉛能力，圖中所反映的是BL 21大腸桿菌和FP 2000在不同濃度Pb2+的培養基中的生長狀況，可以看出，在Pb2+濃度較低（0mg/L和100mg/L）時，37℃，180rpm培養5h后，在595nm下測得的OD值在1.3-1.7之間，生長狀況差異比較小，但隨著Pb2+濃度升高（100mg/L和2000mg/L），兩種菌在595nm下測得的OD值都有所下降，BL 21大腸桿菌的生長明顯受到了Pb2+的抑制，而FP 2000菌生長的OD值下降速度較緩，在1.0以上，說明FP 2000菌具有對Pb2+的抗性，并可在Pb2+濃度達2000mg/L的培養基中正常生長。

圖5 FP 2000菌的抗鉛能力

如圖6、圖7所示，重金屬的濃度較低（100mg/L）時Pb2+、Zn2+和Ni2+離子對該菌的生長影響很小，在5h后吸光度與對照組差別并不大，而Cd2+和Ag+則明顯影響了該菌的正常生長；當金屬離子濃度較高時（500mg/L）時，Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+對該菌的抑制作用比較明顯，菌液的吸光度均小于1.0，而Pb2+對該菌生長狀況影響不大，這說明FP 2000菌對Pb2+具有抗性的，而對Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+抗性較低。

圖7 FP 2000菌對高濃度重金屬的耐受性

2.3 FP 2000菌16S rDNA的提取及鑒定

將測序獲得的16S rDNA序列美國基因數據庫（Gen-Bank）比對，對獲得的同源序列進行序列分析，采用MEGA 5.05軟件構建進化樹。如圖8所示。該菌的16S rDNA序列與克雷伯氏菌同源性達到99%，因此可以判定FP 2000菌屬于克雷伯氏菌。

圖8 FP 2000菌系統進化樹

3 結論

從電鍍廠附近的土壤中，分離、篩選出1株高對濃度為2000mg/L的Pb（NO3）2具有抵抗能力的細菌：FP 2000。對FP 2000該菌進行革蘭氏染色，并對該菌株16S rDNA進行測序比對，結果表明：FP 2000為革蘭氏陰性菌，該菌是歸屬于克雷伯氏菌；并對該菌進行條件優化實驗，最適合的生長條件為：溫度34～40℃，pH值4～6，在普通LB液體培養基中3～7小時達到對數生長期，以上結論說明該菌對環境條件要求較低，有很好應用前景。

對于該菌的耐鉛機制，目前還不清楚。今后將開展對菌株降解動力學、降解途徑、細菌降解后產物以及降解含丙烯酰胺污水的室內實驗研究。

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