高效液相色譜 電感耦合等離子質譜法分析雄黃在大鼠臟器中代謝的砷形態

陳紹占+杜振霞+劉麗萍+姜泓

摘 要 采用HPLC ICP MS 聯用技術建立了大鼠臟器中AsB， As， MMA， DMA和As等砷形態的分析方法。采用超聲水浴提取對樣品進行前處理，Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱，20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH 9.7）為流動相，對雄黃染毒后大鼠肝腎中的砷形態進行分析。實驗表明，方法不受40Ar35Cl+干擾，常見的5 種砷形態化合物的線性范圍為1～300 μg/L，相關系數（R2）均大于0.999，檢出限為0.3～0.5 （μg/L）， RSD 均小于5%，加標回收率為83.8%～111.7%。通過對肝腎的形態分析，表明經雄黃染毒后大鼠肝臟中的砷形態主要為DMA、As和未知物2；腎臟中的砷形態主要為DMA、MMA、As、未知物1、未知物2 和未知物3。綜合表明，此方法適用于雄黃代謝后的主要砷形態分析。

關鍵詞 雄黃； 砷形態； 臟器； 高效液相色譜 電感耦合等離子質譜

1 引言

近年來，中藥慢性中毒問題受到人們的高度重視。中藥雄黃在我國傳統醫學中有著悠久的歷史，具有解毒殺蟲，燥濕祛痰，截瘧等功效[1]。2010 年版《中國藥典》[1]規定雄黃飲片中As2S2的含量應不低于90%，并對As2O3的量進行了限制。現代醫學研究表明，雄黃在治療白血病[2]、癌癥[3]等惡性疾病方面也有不錯的療效。盡管雄黃具有這種獨特的療效，但由于其屬于含砷礦物藥，使其具有一定的毒性，而其毒性大小與砷的化學形態密切相關[4～6]。Rana等[7]報道了，砷暴露可通過干擾抗氧化防御系統和減小SOD2 的基因表達，從而對肝、腎造成損傷。

目前，測定砷形態的分析方法主要有高效液相色譜與電感耦合等離子質譜聯用技術（HPLC ICP MS）[8～10]、高效液相色譜與氫化物發生 原子熒光聯用技術（HPLC HG AFS）[11，12]、高效液相色譜與氫化物發生 原子吸收聯用技術（HPLC HG AAS）[13]、毛細管電泳與電感耦合等離子質譜聯用技術（CE ICP MS）[14，15]、高效液相色譜與電噴霧離子質譜聯用技術（HPLC ESI MS）[16]，主要用于食品等領域的測定，未見在雄黃代謝中應用的報道。

本實驗建立了HPLC ICP MS測定雄黃在大鼠肝腎中代謝砷形態的方法，為研究雄黃在大鼠體內的代謝提供支持，同時考察了樣品前處理過程中砷形態之間的轉化，并運用此法對雄黃在大鼠肝、腎中代謝后的砷形態進行了初步研究，為進一步研究雄黃的藥代動力學提供合適的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200 型高效液相色譜儀及7500a 型電感耦合等離子體質譜儀（ICP MS，美國Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超純水處理系統（美國Millipore 公司）；數控超聲清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）。

（NH4）2CO3， NH3·H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均為優級純；砷標準物質：亞砷酸根離子＼[As]、 砷酸根離子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜堿（AsB），均購于中國計量科學研究院。超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

2.2 質譜與色譜條件

ICP MS 條件：RF入射功率1450 W，載氣為高純氬氣，載氣流速0.65 L/min，輔助氣流速0.45 L/min， 射頻電壓1.72 V，采樣深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，檢測同位素 75As和35Cl。

HPLC 條件：Dionex IonPac AS 19 陰離子分析柱；流動相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱溫為室溫；進樣體積：25 μL。

2.3 染毒方法

取4周齡Wistar大鼠4只，體重（50 ± 10）g。分為低、中、高劑量組，給藥劑量分別為0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 為混懸介質），對照組給予0.5 % CMC （羧甲基纖維素鈉），雄黃染毒組灌胃給藥，每天灌胃1 次，連續6星期。染毒期間每3 天稱重1 次，調節灌胃劑量。實驗動物室溫度（24±1） ℃， 相對濕度（50±5）%，每天12 h光照，動物可自由攝食攝水。于末次給藥2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝臟和腎臟。

2.4 樣品前處理方法

稱取0.3～0.4 g （精確到0.001 g）粉碎后的試樣，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，渦旋混勻后，60 ℃ 水浴超聲2 h， 于4 ℃ 冰箱中靜置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min離心10 min，上清液過0.2 μm濾膜。同時制備各試劑空白溶液。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化

陰離子交換色譜和陽離子交換色譜均可用于砷形態分析。根據砷化合物的離子特性，陰離子交換色譜通常用來分析As、As、MMA 和 DMA，而陽離子交換色譜用于分離AsB、AsC、TMAO 和TETRA。

在陰離子交換色譜中，AsB 和As在中性pH 條件下于死體積處共洗脫。通過向流動相中加入酒石酸后，使As與酒石酸形成陰離子的絡合物，在色譜柱內產生較強的保留特性，從而使As與AsB 分開[17]。也可通過增大pH值至9.0 以上[18]或將As氧化成As實現與AsB 的分離。

本實驗采用Dionex IonPac AS 19陰離子色譜柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流動相，對流動相的pH 值和流速進行了優化。

不同pH值條件下，5 種砷形態的保留時間如圖1 所示。pH 值的變化對AsB、DMA 和As的保留時間影響較小，但可使MMA 和As的保留時間明顯縮短。這是由于調pH 值時，氨水的含量的增加改變了流動相的陰離子強度，增強了流動相的洗脫能力。從減少測樣時間和避免對儀器的損害角度考慮，pH=9.7 為宜。

考察了1.0， 1.2和1.5 mL/min流速下的分離效果，結果表明，當流速為1.0 和1.2 mL/min 時，5種不同砷形態能夠完全分離； 而流速為1.2 mL/min 時，測定樣品用時較短。1.5 mL/min 流速下，DMA 和As不能達到基線分離。

綜上所述， 選用20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7），流速為1.2 mL/min，柱溫為室溫，進樣體積為25 μL的條件進行后續實驗。

3.2 離子強度和ArCl+的干擾

樣品中存在的其它離子會影響流動相的離子強度，從而也會影響砷形態在色譜柱里的分離；并且35Cl 在等離子體中會與40Ar 形成40Ar35Cl+ 多原子離子干擾75As 的測定。配制不同濃度NaCl 來考察40Ar35Cl 和離子強度對分離效果的影響。

分別配制了NaCl濃度為50， 150， 300， 600 和900 mg/L的5 種砷形態的混合標準溶液（10 μg/L），測試結果表明，在此分離條件下，NaCl 濃度對5 種砷化合物的出峰時間幾乎無影響。但濃度大于600 mg/L 后，在5.58 min 出現了1個干擾峰，與35Cl+出峰時間一致，因此可以確定為75Ar35Cl+干擾峰，由于此峰不干擾其它砷形態的測定，所以在此分離條件下40Ar35Cl+ 對測定結果沒有干擾。圖2為75As 和35Cl 的色譜圖。

3.3 砷形態之間轉化考察

在對肝腎樣品形態分析過程中，發現提取液放置時間過長會發生形態之間的轉化，因此設計了砷形態之間的轉化實驗。考慮到水基質簡單，As容易被氧化，而提取液中往往含有還原性有機質，因此，進一步用提取液配制成100 μg/L的混合標準溶液，再分別加入0， 2%， 5%， 10%和15%的H2O2，60 ℃加熱1 h，上機測定。結果表明，加入2% 及更高濃度的H2O2后，As被完全氧化為As。后續實驗中加入5% H2O2，氧化后的色譜圖如圖3 所示。在此氧化條件下，AsB， DMA 和MMA 的回收率分別為98%， 92%和95%。說明AsB， DMA 和MMA 在此氧化條件下比較穩定，不易發生轉化。

3.4 前處理方法的選擇

根據參考文獻＼[19～21]報道，目前砷形態分析的主要前處理方法為水、水 乙酸（19∶1，V/V）、甲醇 水（1∶1，V/V） 3 種體系。水作為提取劑主要用于大米等基質相對簡單的樣品的處理，對脂肪含量較高的樣品，提取效率較低。甲醇 水作提取劑可保持各化合物形態、避免形態之間的轉化。有機砷提取效率較高；但甲醇含量過高會降低無機砷的提取效率。由于高濃度的甲醇會影響砷測定時的靈敏度，特別是采用HPLC ICP MS時碳在錐孔處易富集，影響測定結果。一般需采用旋轉蒸干或氮吹方法去除甲醇，稀釋后上機測定；前處理方法較繁瑣，回收率偏低。而采用水 乙酸（19∶1，V/V） 提取時， 回收率均在80%～120% 之間，前處理過程簡單。經優化實驗，本方法選用水 乙酸（19∶1，V/V）作為砷形態的提取試劑。

3.5 方法的線性范圍及檢出限

分別配制了1.0， 5.0， 10， 25， 50， 100， 200和300 μg/L的5 種砷形態混合標準系列。在優化的實驗條件下進行分析，1～300 μg/L 范圍內，相關系數R2>0.999，結果如表1 所示。采用逐級稀釋法，在0.3 μg/L時，AsB， DMA 和As的信噪比（S/N） 大于3；在0.5 μg/L 時，MMA、As的信噪比（S/N） 大于3。因此， 確定AsB，DMA 和As的檢出限為0.3 μg/L，MMA 和As的檢出限為0.5 μg/L。

3.6 方法的精密度及加標回收率

由于未發現同時存在5種砷形態化合物的樣品，因此在雄黃染毒樣品中分別加入3種質量濃度水平的5 種砷形態混合標準溶液，制備成6 個模擬樣品，進行回收率和精密度實驗，結果見表2。5 種砷形態化合物的加標回收率在83.8%～111.7% 之間，相對標準偏差RSD<5%。

4 結 論

建立的HPLC ICP MS 方法適用于雄黃代謝后大鼠臟器中砷形態分析；雄黃代謝后大鼠肝臟中砷形態主要以DMA 形式存在，存在少量的As和未知物2；腎臟中的砷形態主要以DMA ，MMA，As、未知物1、未知物2 和未知物3 形式存在。

References

1 National Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People′s Republic of China .Chinese Medical Science and Technology Press， 2010： 316

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）. 中國醫藥科技出版社， 2010： 316

2 Luo Ya qin， Xu Rui Rong.Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine，2011， 31（7）： 703-706

羅雅琴， 徐瑞榮. 吉林中醫藥， 2011， 31（7）： 703-706

3 LIN Mei， PEI Jun Chang， ZHANG Dong Sheng， YE Jun.China Practical Medical，2007， 2（13）： 1-4

林 梅， 裴軍昌， 張東生， 葉 軍. 中國實用醫藥， 2007， 2（13）： 1-4

4 GAO Shuang Rong， LIANG Ai Hua， YI Yan， LIU Ting， CAO Chun Yu， WANG Hai Lin， LI Chun Ying， HAO Ran， HUI Lian Qiang.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2011， 17（24）： 243-247

高雙榮， 梁愛華， 易 艷， 劉 婷， 曹春雨， 王海林， 李春英， 郝 然， 回連強. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（24）： 243-247

5 WANG Yong Cheng.Chinese Journal of Forensic Medicine，2007， 22（2）： 125

王永成. 中國法醫學雜志， 2007， 22（2）： 125

6 LIU En Sheng， LI Yu Zhen.Adverse Drug Reactions Journal ，2005， 7（4）： 276-277

劉恩生， 李玉珍. 藥物不良反應雜志， 2005， 7（4）： 276-277

7 Rana T， Bera A K， Das S， Bhattacharya D， Pan D， Das S K.Journal of Biochemical and Molecular Toxicology，2012， 26（3）： 109-116

8 ZHU Zhi Liang， QIN Qin.Spectroscopy and Spectral Analysis，2008， 28（5）： 1176-1180

朱志良， 秦 琴. 光譜學與光譜分析， 2008， 28（5）： 1176-1180

9 Chen B B， Hu B， He N， Mao X J， Zu W Q.J. Chromatogr. A，2012， 1227： 19-28

10 Raber G， Stock N， Hanel P， Murko M， Navratilova J， Francesconi K A.Food Chemistry，2012， 134（1）： 524-532

11 Mato Fernndez M J， Otero Rey J R， Moreda Pineiro J， Alonso Rodríguez E， López Mahía P， Muniategui Lorenzo S， Prada Rodríguez D.Talanta，2007， 71（2）： 515-520

12 Slejkovec Z， Van Elteren J T， Byrne A R.Anal. Chim. Acta，1998， 358（1）： 51-60

13 Sur R， Dunemann L.J. Chromatogr. B，2004， 807（2）： 169-176

14 ZHAO Yun Qiang， ZHENG Jin Ping， YANG Ming Wei， FU Feng Fu.Chinese Journal of Chromatography， 2011， 29（2）： 111-114

趙云強， 鄭進平， 楊明偉， 付鳳富. 色譜， 2011， 29（2）： 111-114

15 HAN Mei，ZHAO Guo Xing，LI Shu Zhen，SUN Zhen Hua，LI Yi， JIA Na.Chinese J. Anal.Chem.，2013， 41（11）： 1780-1781

韓 梅， 趙國興， 李淑珍， 孫振華， 李 義， 賈 娜. 分析化學， 2013， 41（11）： 1780-1781

16 Madsen A D， Goessler W， Pedersen S N， Francesconi K A.J. Anal. Ato. Spectro.，2000， 15（6）： 657-662

17 Zheng J， KosmusW， Pichler Semmelrock F， Kck M.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，1999， 13（3）： 150-156

18 Brima E I， Haris P I， Jenkins R O，Polya D A， Gault A G， Harringtton C F.Toxicology and Applied Pharmacology，2006， 216（1）： 122-130

19 Schaeffer R， Soeroes C， Ipolyi I， Fodor P， Thomaidis N S.Anal. Chim. Acta，2005， 547（1）： 109-118

20 L Chao， LIU Li Ping， DONG Hui Ru， LI Xiao Wei.Journal of Instrumental Analysis，2010， 29（5）： 465-468

呂 超， 劉麗萍， 董慧茹， 李筱薇. 分析測試學報， 2010， 29（5）： 465-468

21 GAO Yang， CAO Xuan， YU Jing Jing， LI Xian Chun， WANG Xiao Ru.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2009， 37（12）： 1738-1742

高 楊， 曹 煊， 余晶晶， 黎先春， 王小如. 分析化學， 2009， 37（12）： 1738-1742

林 梅， 裴軍昌， 張東生， 葉 軍. 中國實用醫藥， 2007， 2（13）： 1-4

4 GAO Shuang Rong， LIANG Ai Hua， YI Yan， LIU Ting， CAO Chun Yu， WANG Hai Lin， LI Chun Ying， HAO Ran， HUI Lian Qiang.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2011， 17（24）： 243-247

高雙榮， 梁愛華， 易 艷， 劉 婷， 曹春雨， 王海林， 李春英， 郝 然， 回連強. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（24）： 243-247

5 WANG Yong Cheng.Chinese Journal of Forensic Medicine，2007， 22（2）： 125

王永成. 中國法醫學雜志， 2007， 22（2）： 125

6 LIU En Sheng， LI Yu Zhen.Adverse Drug Reactions Journal ，2005， 7（4）： 276-277

劉恩生， 李玉珍. 藥物不良反應雜志， 2005， 7（4）： 276-277

7 Rana T， Bera A K， Das S， Bhattacharya D， Pan D， Das S K.Journal of Biochemical and Molecular Toxicology，2012， 26（3）： 109-116

8 ZHU Zhi Liang， QIN Qin.Spectroscopy and Spectral Analysis，2008， 28（5）： 1176-1180

朱志良， 秦 琴. 光譜學與光譜分析， 2008， 28（5）： 1176-1180

9 Chen B B， Hu B， He N， Mao X J， Zu W Q.J. Chromatogr. A，2012， 1227： 19-28

10 Raber G， Stock N， Hanel P， Murko M， Navratilova J， Francesconi K A.Food Chemistry，2012， 134（1）： 524-532

11 Mato Fernndez M J， Otero Rey J R， Moreda Pineiro J， Alonso Rodríguez E， López Mahía P， Muniategui Lorenzo S， Prada Rodríguez D.Talanta，2007， 71（2）： 515-520

12 Slejkovec Z， Van Elteren J T， Byrne A R.Anal. Chim. Acta，1998， 358（1）： 51-60

13 Sur R， Dunemann L.J. Chromatogr. B，2004， 807（2）： 169-176

14 ZHAO Yun Qiang， ZHENG Jin Ping， YANG Ming Wei， FU Feng Fu.Chinese Journal of Chromatography， 2011， 29（2）： 111-114

趙云強， 鄭進平， 楊明偉， 付鳳富. 色譜， 2011， 29（2）： 111-114

15 HAN Mei，ZHAO Guo Xing，LI Shu Zhen，SUN Zhen Hua，LI Yi， JIA Na.Chinese J. Anal.Chem.，2013， 41（11）： 1780-1781

韓 梅， 趙國興， 李淑珍， 孫振華， 李 義， 賈 娜. 分析化學， 2013， 41（11）： 1780-1781

16 Madsen A D， Goessler W， Pedersen S N， Francesconi K A.J. Anal. Ato. Spectro.，2000， 15（6）： 657-662

17 Zheng J， KosmusW， Pichler Semmelrock F， Kck M.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，1999， 13（3）： 150-156

18 Brima E I， Haris P I， Jenkins R O，Polya D A， Gault A G， Harringtton C F.Toxicology and Applied Pharmacology，2006， 216（1）： 122-130

19 Schaeffer R， Soeroes C， Ipolyi I， Fodor P， Thomaidis N S.Anal. Chim. Acta，2005， 547（1）： 109-118

20 L Chao， LIU Li Ping， DONG Hui Ru， LI Xiao Wei.Journal of Instrumental Analysis，2010， 29（5）： 465-468

呂 超， 劉麗萍， 董慧茹， 李筱薇. 分析測試學報， 2010， 29（5）： 465-468

21 GAO Yang， CAO Xuan， YU Jing Jing， LI Xian Chun， WANG Xiao Ru.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2009， 37（12）： 1738-1742

高 楊， 曹 煊， 余晶晶， 黎先春， 王小如. 分析化學， 2009， 37（12）： 1738-1742

林 梅， 裴軍昌， 張東生， 葉 軍. 中國實用醫藥， 2007， 2（13）： 1-4

4 GAO Shuang Rong， LIANG Ai Hua， YI Yan， LIU Ting， CAO Chun Yu， WANG Hai Lin， LI Chun Ying， HAO Ran， HUI Lian Qiang.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2011， 17（24）： 243-247

高雙榮， 梁愛華， 易 艷， 劉 婷， 曹春雨， 王海林， 李春英， 郝 然， 回連強. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（24）： 243-247

5 WANG Yong Cheng.Chinese Journal of Forensic Medicine，2007， 22（2）： 125

王永成. 中國法醫學雜志， 2007， 22（2）： 125

6 LIU En Sheng， LI Yu Zhen.Adverse Drug Reactions Journal ，2005， 7（4）： 276-277

劉恩生， 李玉珍. 藥物不良反應雜志， 2005， 7（4）： 276-277

7 Rana T， Bera A K， Das S， Bhattacharya D， Pan D， Das S K.Journal of Biochemical and Molecular Toxicology，2012， 26（3）： 109-116

8 ZHU Zhi Liang， QIN Qin.Spectroscopy and Spectral Analysis，2008， 28（5）： 1176-1180

朱志良， 秦 琴. 光譜學與光譜分析， 2008， 28（5）： 1176-1180

9 Chen B B， Hu B， He N， Mao X J， Zu W Q.J. Chromatogr. A，2012， 1227： 19-28

10 Raber G， Stock N， Hanel P， Murko M， Navratilova J， Francesconi K A.Food Chemistry，2012， 134（1）： 524-532

11 Mato Fernndez M J， Otero Rey J R， Moreda Pineiro J， Alonso Rodríguez E， López Mahía P， Muniategui Lorenzo S， Prada Rodríguez D.Talanta，2007， 71（2）： 515-520

12 Slejkovec Z， Van Elteren J T， Byrne A R.Anal. Chim. Acta，1998， 358（1）： 51-60

13 Sur R， Dunemann L.J. Chromatogr. B，2004， 807（2）： 169-176

14 ZHAO Yun Qiang， ZHENG Jin Ping， YANG Ming Wei， FU Feng Fu.Chinese Journal of Chromatography， 2011， 29（2）： 111-114

趙云強， 鄭進平， 楊明偉， 付鳳富. 色譜， 2011， 29（2）： 111-114

15 HAN Mei，ZHAO Guo Xing，LI Shu Zhen，SUN Zhen Hua，LI Yi， JIA Na.Chinese J. Anal.Chem.，2013， 41（11）： 1780-1781

韓 梅， 趙國興， 李淑珍， 孫振華， 李 義， 賈 娜. 分析化學， 2013， 41（11）： 1780-1781

16 Madsen A D， Goessler W， Pedersen S N， Francesconi K A.J. Anal. Ato. Spectro.，2000， 15（6）： 657-662

17 Zheng J， KosmusW， Pichler Semmelrock F， Kck M.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，1999， 13（3）： 150-156

18 Brima E I， Haris P I， Jenkins R O，Polya D A， Gault A G， Harringtton C F.Toxicology and Applied Pharmacology，2006， 216（1）： 122-130

19 Schaeffer R， Soeroes C， Ipolyi I， Fodor P， Thomaidis N S.Anal. Chim. Acta，2005， 547（1）： 109-118

20 L Chao， LIU Li Ping， DONG Hui Ru， LI Xiao Wei.Journal of Instrumental Analysis，2010， 29（5）： 465-468

呂 超， 劉麗萍， 董慧茹， 李筱薇. 分析測試學報， 2010， 29（5）： 465-468

21 GAO Yang， CAO Xuan， YU Jing Jing， LI Xian Chun， WANG Xiao Ru.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2009， 37（12）： 1738-1742

高 楊， 曹 煊， 余晶晶， 黎先春， 王小如. 分析化學， 2009， 37（12）： 1738-1742