細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子和血管內皮生長因子在骨巨細胞瘤中的表達及臨床意義

黃永惠，葉頂瓊，王運飛（四川省隆昌縣人民醫院：.腫瘤科；.神經內科 6450）

骨巨細胞瘤（GCT）是一種具有潛在侵襲及惡變的良性原發性腫瘤，主要發生于20～40歲的女性，據統計資料顯示，我國GCT發病率高于西方國家［1］。GCT患者病灶主要位于骨骺，可擴展至干骺端甚至骨干。股骨遠端、橈骨遠端、脛骨近端、肱骨近端、骶骨為GCT常見的發病部位。GCT患者約80%為良性，25%～50%患者經治療后復發，少數病情嚴重患者會發生肺轉移，極少患者在放療或復發后惡變。目前，臨床上最常用Jaffe′s、Enennecking和Campanacci外科分期法來劃分GCT腫瘤期限，但這些分級并不能準確預測GCT的生物學行為。因此，需要探尋一種有效預測GCT生物學行為及預后的相關檢測指標［2］。本研究對細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（EMMPRIN）-CD147、血管內皮生長因子（VEGF）在GCT組織中的表達情況進行研究，并分析其與臨床病理及預后的關系，旨在為臨床準確判斷GCT生物學行為及預后評估提供參考，為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源選擇本院2010年2到2013年4月收治的GCT患者68例，其中男29例，女39例，年齡13～56歲，平均年齡（33.5±4.7）歲，均行手術治療。其中8例行刮除；24例行刮除+骨移植；6例行切除+骨移植；16例行切除+人工關節置換；14例行切除+植骨。病變及取材部位：脊柱6例、尺骨2例、橈骨5例、股骨23例、脛骨10例、骶骨10例、髖骨5例、指骨7例。本研究選取的標本均經病理組織學證實為GCT并參照Jaffe′s外科分級標準［3］：Ⅰ級25例，Ⅱ級34例，Ⅲ級9例。入選標本均為患者手術過程中刮除或切除組織經10%中性甲醛固定，采用石蠟包埋，Ameritool公司生產的切片機4μm連續切片，并進行常規HE染色。

1.2 試劑及設備試劑免疫組化染色試劑盒（CW0118A），濃縮型DAB試劑盒（C0168），抗原修復液（SBT10001），兔抗人CD147（10186-RP01）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、VEGF多克隆抗體（HG10008-M）均購于北京中衫金橋公司；PBS（D3183）、蘇木精（GT-5084）均購于西安科昊公司。Ameritool公司生產的切片機（DYQ-401K）、Olympus公司生產的顯微鏡（EXTECH-MC200）、Eppendorf公司生產的離心機（ROTOLAVTT細胞洗滌離心機）、GILSON公司生產的移液槍（Pipetman Ultra）、江蘇南通金余公司生產的水浴箱（CJB-S 140mm×140mm）。Siemens公司生產的4℃冰箱（MBC-4V368）。

1.3 方法

1.3.1 S-P染色方法 石蠟包埋后，4μm連續切片，隨后常規脫蠟置水。每張切片抗原修復處理3次，每次2min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5min，于室溫下使用3%雙氧水處理，時間為15min，以徹底將內源性過氧化物酶活性消除。再用PBS沖洗3次，每次5min，于室溫下滴加5%山羊血清封閉液，保持30min，將多余的液體除去。加入一抗，CD147（1∶100）、MMP-2（1∶100）、MMP-9（1∶150）、VEGF（1∶100），將其置于4℃冰箱中過夜。于37℃下孵育1h。PBS沖洗，每張切片處理3次，每次5min，加入通用的二抗后處理30min。PBS沖洗，每張切片處理3次，每次5min，加入辣根酶表決鏈霉素卵白素液后處理30min。PBS沖洗，每張切片處理3次，每次5min，DAB試劑顯色，并于顯微鏡下仔細觀察，5～15 min后水洗并終止顯色反應。蘇木精復染，脫水，透明，封片。于高倍鏡下觀察每張切片，選取5個不同視野，觀察陽性細胞的數量以及染色情況，陽性細胞為胞漿或胞膜淺黃色或棕黃色，綜合陽性細胞數量以及染色強度進行分級［4］。陽性細胞所占百分比分級評分標準：1分（1%～25%）、2分（＞25%～50%）、3分（＞50%～75%）、4分（＞75%）；染色程度分級評分標準：0分（無色）、1分（淺黃 色）、2分（黃色）、3分（棕黃色）。上述陽性細胞所占百分比分級評分×染色程度分級評分后分為4個等級：0～1分為（-）、2～3分為（+）、4～5分為（++）、＞6分為（+++）。

1.3.2 胃癌微血管密度計數方法 GCT內任一的孤立棕黃色細胞或細胞簇均視為一條單獨的血管，有無官腔以及紅細胞并不作為判定為血管的必要條件，已經形成的肌層血管、分辨不清、染色模糊的細胞不計，于低倍鏡下找到內含微血管最為豐富的腫瘤組織即“熱點”，再于高倍鏡下計數3個視野內的微血管數目，取其平均值分析。

1.4 統計學處理選擇SPSS18.0軟件包對數據進行統計分析，CD147、VEGF、MMP-9和患者性別、年齡、分級、預后之間的關系采用非參數秩和檢驗，CD147和VEGF、MMP-9、MMP-2表達的相關性采用Spearmen分析，檢驗標準為α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 染色結果分析 CD147于GCT組織中染色強度不一，單核機制細胞胞漿內和包膜上主要表達呈棕黃色顆粒狀的陽性物質，多核巨細胞也會存在少量的表達。MMP-2、MMP-9主要表達于多核巨細胞，呈現胞漿著色，棕黃色為陽性物質，在部分單核基質細胞中也有一定的表達。VEGF陽性表達于細胞質內，多核和單核細胞內均有表達。

2.2 CD147、VEGF陽性表達和臨床病理參數的關系分析

患者性別、年齡等一般情況與CD147、VEGF陽性表達無相關（P＞0.05）。各級Jaffe′s評級患者CD147和MMP-2陽性表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），預后各分組患者CD147、MMP-2、MMP-9陽性表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 Jaffe′s分級和預后和CD147、VEGF陽性表達的關系（n）

續表1 Jaffe′s分級和預后和CD147、VEGF陽性表達的關系（n）

2.3 CD147和VEGF陽性表達相關分析通過Spearman相關性分析，CD147的表達和MMP-9、VEGF的表達呈正相關（r=0.696，P=0.025；r=0.674，P=0.000）。

3 討 論

GCT是一種常見的骨原發性良性腫瘤，具有一定的惡變能力，主要由單核細胞樣細胞、單核基質細胞、多核巨細胞組成，但是上述細胞的起源和在腫瘤發生及發展過程中的相關作用還需臨床進一步深入研究。另外，GCT發生和發展涉及眾多細胞因子以及信號通路，其相關作用機制也尚未闡明。臨床上治療GCT首選方式為手術治療，但術后患者仍存在復發及惡變的可能［5］。

1982年Biswas發現CD147屬于免疫球蛋白超家族成員且廣泛表達于細胞表面的跨膜糖蛋白，為多效性分子，在胎兒的發育以及視網膜功能方面起著至關重要的作用，同時，胸腺T細胞的發展，淋巴細胞應答程序、組織重建、空間認知、精子發生等都有密切關系［6］。除了上述作用之外，CD147還在腫瘤的發生、發展以及侵襲轉移過程中發揮著重要的作用，主要表現為以下幾個方面。（1）促進腫瘤的侵襲和轉移；（2）誘導腫瘤血管的生成；（3）促進腫瘤細胞的錨著非依賴性生長。CD147在腫瘤發展過程中還可以刺激并誘導MMP的生成，近年研究發現，CD147還能直接誘導腫瘤細胞產生MMP［7］。

體內外臨床研究顯示，CD147表達和VEGF誘導具有十分密切的關系，CD147過度表達時可刺激腫瘤生長及血管生成。對于CD147糖基化的研究報道顯示，CD147功能和附著糖的類型與腫瘤存在直接聯系，由此可推測細胞外基質在CD147糖基化過程中發揮著重要的作用，同時考慮到MMP的表達誘導也需要糖基化，由此提示，糖基化過程可能是調控CD147的重要機制，可作為今后治療方向進行研究［8］。

近年來，越來越多的臨床研究證實了腫瘤的組織學表現和生物學行為之間存在不一致性，Jaffe′s分級以及Enneking影像學分級雖具有判定GCT局部浸潤的作用，但是無法預測其復發和轉移。本研究結果顯示，患者性別、年齡等一般資料與CD147、VEGF陽性表達無相關（P＞0.05）。由此說明患者年齡、性別不能作為判斷GCT侵襲以及復發的指標。各級Jaffe′s患者CD147和MMP-2陽性表達差異有統計學意義（P＜0.05），預后各分組患者CD147、MMP-2、MMP-9陽性表達差異有統計學意義（P＜0.05）。提示CD147、MMPs、GCT侵襲和預后有關，可作為臨床評估GCT患者預后的重要參考指標。另外，CD147和VEGF、MMP-9等因子表達呈正相關，此結論和宮頸癌等腫瘤組織情況相似，由此提示CD147可能促進VEGF的表達，并通過降解細胞外基質和促進腫瘤血管生成，為腫瘤的增殖以及轉移提供有利條件［8］。

綜上所述，CD147的陽性表達和GCT患者病情惡化以及復發有著密切的關系，并且和MMP-9、VEGF的陽性表達密切相關，是目前臨床上評價GCT惡性程度以及評估預后的重要檢測指標。

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［5］韓躍虎，楊柳，黃景輝，等.CD147、PCNA、VEGF和MMPs在骨巨細胞瘤中的表達及臨床意義［J］.中國骨與關節外科，2012，5（1）：65-71.

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［8］李翀，李海，馮一中.骨巨細胞瘤中Skp2、p27及E2F-1的表達及意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2011，27（11）：1202-1205.