氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌協作下Q235鋼腐蝕行為

杜 娟 李松梅 劉建華 于 美

(北京航空航天大學 材料科學與工程學院，北京100191)

微生物廣泛存在于潮濕空氣及水環境中，當材料處于微生物環境下，其腐蝕過程由簡單的電化學過程變得更為復雜.受微生物影響的金屬及合金的腐蝕稱為微生物腐蝕(MIC，Microbiologically Influenced Corrosion).其本質是微生物新陳代謝的產物通過影響腐蝕反應的陰極過程或陽極過程，從而影響腐蝕速率和類型［1］.微生物腐蝕給工業設備、民用設施等都造成了不同程度損失，尤其是對航空航天和航運機器油箱及零部件的腐蝕行為造成了巨大的安全隱患［2－4］.目前，關于微生物腐蝕的報道已涉及了各種材料的應用領域［5－11］.

氧化硫硫桿菌(T.t，Thiobacillus thiooxidans)是一種礦質化能自養菌，由于其優異的浸礦及脫硫能力而廣泛地應用在工業領域;芽孢桿菌(Bacillus)是一種好氣性異養菌，對其研究主要集中在工業、農業、醫藥等方面.本課題組對于氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌單獨存在時的微生物腐蝕影響做過一些探討［12－13］，但是在自然界中，微生物并不是以單一菌種的形式存在的，各種微生物雜居在一起，混合菌對材料的腐蝕并不是單種細菌腐蝕作用的簡單加和，而是各種細菌共同作用、相互消長的過程［14－15］.本文通過討論 Q235鋼分別在氧化硫硫桿菌、芽孢桿菌、氧化硫硫桿菌－芽孢桿菌3個體系中的腐蝕行為，對混合菌作用的機理進行一些探討，旨在為將來預防和控制航空和工業領域中金屬的微生物腐蝕提供一些理論依據.

1 材料與實驗方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料為Q235鋼，其化學成分如下:C(≤0.3%)，Si(≤0.01%)，Mn(≤0.42%)，S(≤0.029%)，P(≤0.019%).將材料分別加工成20 mm×30 mm×2 mm(長方形)和10 mm×10 mm×2 mm(正方形)2種方形帶孔試片和φ10 mm×10 mm圓形試片.第1種長方形試片打磨至1200#，用于掛片腐蝕實驗并進行腐蝕形貌觀察;另外一種正方形試片打磨至2000#后拋光，用于生物膜觀察;圓形試片做成電極，用于電化學實驗，電極的工作面用水砂紙打磨至1200#.所有試樣均用無菌去離子水沖洗，75%酒精消毒后置于無菌干燥箱中保存，備用.在實驗前再用紫外燈滅菌30 min，確保實驗中無雜菌污染.

1.2 菌種來源與培養

實驗菌種氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌是從成品油的儲油罐底部分離并提純得到的.為了擬合實際環境，培養基采用改良后的Starkey培養基:FeSO40.01 g/L，CaCl20.25 g/L，MgSO40.5 g/L，(NH4)2SO40.3 g/L，KH2PO43.5 g/L，S 5 g/L，與馬鈴薯培養基(PDA，Potato Dextrose Agar)以 2∶1的體積比混合構成混合培養基，pH值4.0±0.1，實驗中所有試劑均為分析純.按無菌操作方法將處于休眠狀態的氧化硫硫桿菌、芽孢桿菌二次活化后，以10%的比例接種于新鮮的混合培養基中，置于37℃恒溫震蕩培養箱(GNP－9270型，上海精宏實驗設備有限公司)中進行培養.氧化硫硫桿菌的計數采用比濁法、芽孢桿菌的計數采用稀釋平板計數法，測得溶液中的活菌數量進而繪制出細菌的生長曲線.

1.3 生物膜分析

將Q235鋼方形試片打磨至2000#，用0.5 μm的研磨膏拋光，丙酮去油，用紫外燈滅菌后浸泡在含有芽孢桿菌的腐蝕體系中，7 d后取出，干燥，然后用掃描電鏡(JSM－5800型，日本造)觀察生物膜形貌，并利用傅里葉紅外光譜儀(360FT－IR ESP型，Nicolet造)對生物膜成分進行分析.

1.4 腐蝕產物形貌及失重分析

將已滅菌的帶孔長方形Q235鋼片分別浸在剛剛接種有氧化硫硫桿菌、芽孢桿菌以及氧化硫硫桿菌－芽孢桿菌的3個含菌體系中，每組3個平行試樣，21 d后將其從腐蝕介質中取出，用掃描電子顯微鏡觀察腐蝕產物的形貌、徹底去除腐蝕產物后的試樣腐蝕形貌及用失重法計算平均腐蝕速率.

1.5 電化學測試

電化學測試采用儀器為美國PAR2273電化學工作站.工作電極為Q235鋼，參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為大面積鉑電極.測量工作電極在空白培養基中和有菌體系中浸泡0，2，7，14，21 d的電化學交流阻抗譜(EIS，Electrochemical Impedance Spectroscopy)及極化曲線.EIS在自腐蝕電位下進行測試，激勵信號為5 mV的正弦波，測試頻率范圍為0.01 Hz～105Hz.極化曲線的測定采用動電位掃描方式，電位掃描速度為0.5 mV/s.

2 實驗結果與討論

2.1 微生物的生長

圖1為氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌在混合培養基中的生長曲線.由圖1可以看出所有細菌在接入培養基后，都經歷了遲緩期、對數生長期、穩定生長期和衰亡期4個生長時期.由于環境發生變化，氧化硫硫桿菌需要適應新的pH值、氧濃度、溫度等條件，暫時缺乏足夠的能量和必需的生長因子，故在接種后的一天，氧化硫硫桿菌的數量沒有太大變化.從第2天起，氧化硫硫桿菌進入對數生長期，并在第5天達到最大值，這段時間細菌以最大的速率生長和分裂，導致細菌數量呈對數增加，所有細胞呈彼此相對穩定速度合成.對數生長期細菌的代謝活性高而穩定，生命力強.從第5天～第7天，由于營養物質消耗、代謝產物積累和pH等環境變化，環境條件逐步不適宜于細菌生長，導致細菌增長速率降低直至零(即細菌分裂增加的數量等于細菌死亡數量)，此時氧化硫硫桿菌處于穩定生長期，保持最高的活細菌數量.從第7天起，伴隨著營養物質耗盡和有毒代謝產物的大量積累，細菌死亡速率逐步增加和活細菌逐步減少，氧化硫硫桿菌進入衰亡期，這個時期細菌的代謝活性降低，細菌衰老并出現自溶.芽孢桿菌與氧化硫硫桿菌不同，在接入培養基后很快就進入了對數生長期，并在第7天達到了最大值，這段時間內細菌的新陳代謝最為旺盛、活性最大.在第7天～第14天，微生物生長進入穩定期，這段時間微生物的活性開始下降，只是維持數量基本不變，直至第14天，細菌數量開始減少，活性大幅度下降.

圖1 氧化硫硫桿菌－芽孢桿菌在混合培養基中的生長曲線

2.2 生物膜形貌觀察與成分分析

在水環境中，微生物是傾向于以吸附在固體材料表面的形式存在的.當一個物體浸沒入水中后，首先是有機碎片粘附在表面上，形成一層薄膜.然后細菌在表面上附著，開始生長繁殖，形成一層黏膜，稱為微生物膜(biofilms)［16］，同時很快就會分泌胞外聚合物(EPS，Extracelular Polymer Substances)，這層分泌物將微生物牢牢地固定在材料表面.生物膜附著的不均勻性可導致材料表面電化學性質不同，再加上細菌代謝物的作用，因此生物膜可引起嚴重的材料腐蝕，損害保護性涂層，甚至對陰極保護系統產生不同程度的影響［17］.圖2為分別浸泡在氧化硫硫桿菌、芽孢桿菌以及氧化硫硫桿菌－芽孢桿菌混合體系中7 d后，Q235鋼表面形成的生物膜形貌圖及相應的傅里葉變換紅外光譜圖.

圖2a為Q235鋼在氧化硫硫桿菌體系中浸泡形成的生物膜形貌.從圖中可以看出，氧化硫硫桿菌形成的生物膜呈現較多層次，由里至外依次為桿狀細菌(圖中箭頭所指)、片狀產物和絲狀產物.這可能是由于此時細菌生長已經達到穩定期，腐蝕行為發生得較為充分，生物膜中還摻雜了腐蝕產物的原因，膜層較為疏松.圖2b為Q235鋼在芽孢桿菌體系中浸泡形成的生物膜形貌，從圖中可以看出，雖然該膜層上細菌(圖中箭頭所指)分布并不十分均勻，但膜層相對致密，對于基體有一定的保護作用.與單種微生物構成的體系相比，圖2c中混合菌體系中的生物膜形貌更為復雜，該表面生物膜形貌SEM圖及傅里葉變換紅外光譜圖體系中的生物膜具有較為明顯的層次感和不均勻性.從形貌圖的左半部分可以看出，膜層由里到外依次為條狀產物、片狀產物和絲狀產物.從形貌圖的右半部分可以看出，由里到外依次為短小的桿狀細菌(圖中箭頭所指)、片狀產物和絲狀產物.膜層整體與氧化硫硫桿菌體系相似，這可能是由于第7天時氧化硫硫桿菌已經度過了對數生長期和穩定期，細菌的代謝活動較為充分，其對混菌中生物膜的結構起到關鍵作用;同時，由于芽孢桿菌的加入，其更為致密的成膜方式使得混菌體系中的生物膜在具備氧化硫硫桿菌生物膜形貌的基礎上發展得更為完整和豐富，2種微生物相互影響，得到了3個體系中最為致密的生物膜.

圖2 在不同體系中浸泡7 d后Q235鋼

比較Q235鋼在不同體系浸泡形成生物膜的傅里葉紅外光譜圖，可以看出，雖然是不同微生物作用下形成的生物膜，但在成分上基本相似，只是在吸收峰的強度上有所差別，這可能與部分基團的含量及生物膜的致密度等有關.圖中3 418～3435 cm－1處的吸收峰與—O—H基團有關，2920～2975 cm－1的吸收峰為—C—H伸縮振動的特征峰，1 631～1 640 cm－1處的吸收峰是由官能團—C＝C伸縮振動引起的，1384～1387 cm－1處的吸收峰是由—CH(CH3)2引起的，1047 cm－1左右的吸收峰是—C—O所特有的，802～870 cm－1處的吸收峰只在氧化硫硫桿菌的單菌體系中出現，這可能與＝C—H有關.

2.3 腐蝕形貌及失重分析

2.3.1 腐蝕產物形貌觀測

圖3為Q235鋼浸泡于不同體系中21 d的腐蝕產物形貌.由圖3a可以看出，氧化硫硫桿菌作用下的產物膜層較為光滑、致密，產物分布較為均勻，沒有明顯的試樣高低起伏.由圖3b中可以看出，芽孢桿菌作用下產物膜層雖然分布比較均勻，各區域的差異性不是很大，但不如氧化硫硫桿菌中膜層光滑、致密，大量的孔洞成為O2分子穿過膜層與基體進行反應的通道.圖3c為Q235鋼浸泡在氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌構成的混合菌系中21 d后的產物形貌.從圖中可以看出，與單菌體系相比，混菌體系的產物膜層雖然更為厚實、完整，但膜層有大量的龜裂現象發生，顯然芽孢桿菌的加入，雖然促進了膜層的發展，但是影響了氧化硫硫桿菌在試樣表面產物層堆積和結合的方式，使得膜層更為疏松.形成這一現象的原因主要為:氧化硫硫桿菌的代謝過程中會與培養基中的S單質反應生成具有更強腐蝕性的SO2－4，在其體系中試樣表面會由于化學反應生成更多的無機腐蝕產物，膜層的致密性受細菌活性的影響較小;而在芽孢桿菌的代謝過程中，生成的胞外聚合物提高了試樣表面微環境的黏稠度，膜層的積累更多是由代謝產物包裹腐蝕產物在表面堆積而成，因此伴隨著微生物活性的下降，胞外聚合物的消融，這種物理性的致密化程度也會大幅下降，使得該體系中膜層較為疏松，但均一性較好;混合菌體系結合了2種菌的代謝特點，一方面在氧化硫硫桿菌作用下腐蝕產物大量形成，另一方面由于胞外聚合物的消融，膜層的粘接力下降，最終出現了多處裂紋.

圖3 Q235鋼在不同體系中浸泡21 d后腐蝕產物形貌SEM圖

2.3.2 腐蝕形貌觀測

圖4為Q235鋼在不同體系中浸泡21 d去除腐蝕產物后的腐蝕形貌圖.由圖4a可以看出浸泡在氧化硫硫桿菌體系21 d后試樣表面較為平整，但存在小的點蝕坑，蝕坑呈方形，且分布比較集中.由圖4b可以看出浸泡在芽孢桿菌體系21 d后蝕坑也為方形，但與氧化硫硫桿菌體系(圖4a)相比，蝕坑要大得多，并且出現了層狀溶解的形貌.圖4c為Q235鋼浸泡在氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌構成的混合菌系中21 d后去除腐蝕產物的形貌圖，與氧化硫硫桿菌單菌體系(圖4a)和芽孢桿菌單菌體系(圖4b)相比，混合菌系中試樣的腐蝕程度介于2個單菌體系之間，蝕坑分布得比氧化硫硫桿菌體系要密，但蝕坑的深度及密度都不及芽孢桿菌體系.此外，蝕坑的形狀并不是單菌體系中的方形，而是圓形小坑逐漸累積形成更大的蝕坑.

圖4 Q235鋼在不同體系中浸泡21 d去除腐蝕產物后的腐蝕形貌SEM圖

2.3.3 腐蝕失重分析

為了便于分析腐蝕的動態過程，分別以0～2d，2～7d，7～14d和14～21d為時間節點，比較不同體系下腐蝕速率隨時間的變化，結果如圖5所示.

圖5 Q235鋼在不同體系中的腐蝕失重速率隨時間變化圖

由圖5可以看出在單菌體系腐蝕速率呈現相似的變化趨勢，第0～2天，由于微生物在試樣表面吸附并開始分泌胞外聚合物，但此階段形成的不完整生物膜無法阻擋溶液中活潑離子對金屬基體的侵蝕，故腐蝕失重速率增大;第2～14天由于生物膜的完整化，有效阻隔了金屬與溶液的直接接觸［18］，此外在生物膜內陸續有腐蝕產物堆積，使得金屬的溶解速率大大降低;第14～21天，伴隨著微生物的消亡、生物膜的活性降低，胞外聚合物的溶解，膜層的致密性降低，使得腐蝕速率又再度上升.Q235鋼在混合菌菌系中腐蝕速率的變化與單菌體系有所不同.在氧化硫硫桿菌與芽孢桿菌的混合菌系中，腐蝕速率在第0～7天持續增加，第7～14天大幅下降，之后又再度增加.前期腐蝕速率持續增大可能與兩微生物相互影響下不易形成更為穩定的生物膜有關;當完整的生物膜形成后，由圖2可以看出，氧化硫硫桿菌與芽孢桿菌共同作用下的生物膜比單菌體系要致密得多，因此，到第14天時，混合菌系的腐蝕速率降低得比2個單菌體系要多;但隨著后期微生物的消亡，試樣表面主要由腐蝕產物起保護作用，比較圖3可以看出，混合菌中產物膜層裂紋更多，所以試樣的腐蝕速率增加的程度大于2個單菌體系，最終腐蝕失重介于2個單菌之間.

2.4 電化學測試結果

2.4.1 開路電位測試

圖6所示為Q235鋼在3個體系中開路電位隨浸泡時間的變化曲線.

圖6 Q235鋼在不同體系中開路電位隨浸泡時間的變化

從圖6中可以看出，單菌體系在第7天時電位達到一個峰值，而混合體系中第14天才達到峰值，這說明相對于單菌體系而言，混菌中生物膜的形成過程更為復雜;此外，對于氧化硫硫桿菌與芽孢桿菌及其構成的混合菌系中，浸泡21d后，氧化硫硫桿菌體系的開路電位最正，這與氧化硫硫桿菌作用下較為致密的產物膜層結構有關，芽孢桿菌的開路電位最負，而兩菌共同作用下的開路電位介于兩者之間，這與腐蝕失重結果相同，芽孢桿菌疏松產物膜層影響了氧化硫硫桿菌在試樣表面產物膜的堆積，使得混菌作用下的腐蝕傾向介于兩者之間.

2.4.2 交流阻抗測試

圖7為Q235鋼在不同體系中0，2，7及14 d的交流阻抗譜圖，對于相同實驗條件下金屬腐蝕性可以用阻抗圖中的低頻段的阻抗值|Z|來表示［19］，結果如表1 所示.

圖7 Q235 鋼分別浸泡在氧化硫硫桿菌(a1，a2，a3)、芽孢桿菌(b1，b2，b3)、以及氧化硫硫桿菌－芽孢桿菌混合體系(c1，c2，c3)中不同天數的電化學阻抗譜

表1 Q235鋼浸泡在不同體系中不同天數的阻抗值Ω

由表1可知，對于3個體系，剛浸泡在相應體系中的試樣具有最小的阻抗值，這是由于培養基中含有大量的侵蝕性活潑離子，對于裸露的金屬表面有著很強的腐蝕性.隨著浸泡時間延續，氧化硫硫桿菌體系中阻抗值出現波動，前期增大是由于生物膜阻隔作用的體現，中期降低是由于氧化硫硫桿菌代謝產物中含有增大了膜內的腐蝕介質濃度引起，后期阻抗再度增大與致密的產物膜有很大關系.芽孢桿菌和混菌體系中阻抗值呈現出相似的變化趨勢，生物膜在腐蝕過程中所起的作用與浸泡時間有關［20］，第0～7天兩體系中均發展出較為致密的生物膜，阻抗值持續上升，第7～14天，當細菌活性下降，生物膜的保護作用減弱，由腐蝕產物膜起到決定性保護作用時，兩體系的阻抗值再度下降.此外，比較第7天的阻抗值，混菌體系阻抗為3個體系中最大;而第14天的阻抗值混菌體系又降為最小，這說明2種微生物共存使金屬表面腐蝕產物膜和生物膜的電阻發生改變［21］，這與生物膜觀察及腐蝕產物觀察所得結論一致，膜層的堆積方式及致密程度對試樣的耐蝕性起到了關鍵作用.

為了進一步闡述膜層結構對腐蝕過程的影響，采用ZSIMPWIN軟件對混菌體系中電極在不同天數測得的阻抗譜進行擬合，所采用的等效電路如圖8所示.

圖8 Q235鋼在氧化硫硫桿菌－芽孢桿菌中浸泡不同天數的等效電路圖

由圖7中的c3可以看出，剛浸泡在混菌體系的試樣只有1個時間常數，即裸露在溶液中的電極表面只存在一個雙電層電容，采用模型圖8a進行擬合;在混菌體系浸泡的第2，7，14天都只有2個時間常數，第2天時表面存在一層未成型生物膜，采用模型圖8b進行擬合;之后的浸泡過程中，氧化硫硫桿菌與芽孢桿菌共同存在時，生物膜的發展比較慢，伴隨著生物膜的逐漸形成，腐蝕產物摻雜于生物膜中，與生物膜雜合成為一個復雜的表面膜層，包覆在試樣表面，采用模型圖8c進行擬合.所得各元件擬合結果見表2.

表2 氧化硫硫桿菌-芽孢桿菌混合菌系等效電路各元件參數

由表2可以看出，第2天時生物膜電阻Rb為258.1 Ω·cm2，第7天時生物膜－產物膜構成的復合膜層電阻為2751.3Ω·cm2，說明隨著生物膜的完整和復雜化，致密的膜層提供了更高的抗腐蝕性;第14天時，復合膜層電阻降低為1057.1Ω·cm2，此時復合膜轉為以腐蝕產物為主導作用的膜層，其疏松的結構決定了其阻值較低，抗腐蝕性能減弱.此外，電荷轉移電阻Rct是評估金屬腐蝕速率的標準［22］，通過比較不同天數的Rct值可以看出，剛浸入液體的試樣(0 d)電荷交換電阻小，腐蝕易發生;第0～7天時Rct大幅增長，這是由于表面形成了厚實的生物膜［23］，試樣表面電化學進程減慢，腐蝕速率減緩;第14天時Rct又極大幅度地降低，試樣表面變得極易發生化學反應，14 d后的腐蝕進程加劇.這與腐蝕失重所得結論一致.

3 結論

1)氧化硫硫桿菌與芽孢桿菌共生情況良好，兩菌共存時生物膜發展較慢，但其既具有氧化硫硫桿菌生物膜的形貌特征，又具有芽孢桿菌的致密性，發展完全的生物膜為所有體系中最完整、最致密的.

2)混菌體系中試樣表面形成的腐蝕產物膜是3個體系中最疏松的;Q235鋼腐蝕形貌出現明顯不同，氧化硫硫桿菌和芽孢桿菌體系中試樣表面均出現方形蝕坑，而兩菌混合體系中試樣表面則出現了獨特的圓形蝕坑腐蝕形貌.

3)腐蝕失重結果表明，第7～14天混菌體系中由于致密生物膜的保護，其腐蝕速率最低;第14～21天由于混菌體系疏松產物膜的影響，其腐蝕速率增幅最大.

4)交流阻抗結果表明，混菌體系中試樣表面膜層阻抗值經歷了先增大后減小的過程.

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