大鯢感染虹彩病毒的診斷和治療

賈秋紅

摘 要：2013年7月，陜西省漢中某大鯢養殖場發生以大鯢體表和四肢多處潰爛并伴有出血為特征的疾病，染病大鯢大量死亡。經臨床觀察、病理解剖及實驗室檢測，最后確診病原為大鯢虹彩病毒。通過采取綜合防治措施，養殖場大鯢疫情得到有效控制。

關鍵詞：大鯢虹彩病毒；診斷；防治

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，有很重要的科研價值及藥用和營養價值。近年來，隨著大鯢人工養殖不斷發展，各種疾病也不斷暴發，尤其是病毒性疾病，給養殖戶造成慘重的經濟損失。2013年7月，陜西省商洛市洛南縣某大鯢養殖場發生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、充血及出血為特征的疾病，經過臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，診斷病原為大鯢虹彩病毒。現將診治結果報道如下。

1 基本情況及臨床癥狀

2013年7月，陜西省商洛某大鯢養殖場大鯢突發異常，行動緩慢，攝食減少，前、后肢嚴重腫脹、潰爛且局部出血，采用肌肉注射青霉素和慶大霉素、頭孢噻吩以及中藥浸泡等治療措施均無效，并在治療過程中陸續死亡，且隨著時間的推移，死亡數量越來越大。

2 病理剖檢

對病死大鯢進行病理剖檢，其結果如下：病死大鯢頭部、前、后肢、尾部嚴重潰爛、腫脹，頸部、腹部、下頜均有大量出血點，腹腔內有淡黃色的積水，肝臟腫大且松軟無彈性，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大有白點。

3 實驗室檢測

3.1 患病大鯢虹彩病毒的細胞擴增檢測

取病死大鯢的肝、腎組織各0.5 g于研磨器中加入2 mL無菌水在低溫下研磨制成懸液，轉移至15 mL離心管，放入-80 ℃反復凍融3次，然后轉移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為病毒提取液備用。取一瓶已培養了48 h的EPC細胞，棄去培養液，吸取0.2 mL病毒提取液接種到此培養瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培養液于25 ℃培養，同時做空白對照，24 h有CPE反應，72 h后CPE反應強烈，細胞已完全脫落，確定患病大鯢為病毒感染，見圖1和圖2。

3.2 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測

取前面已經制備的病毒提取液和陽性對照病毒株（陽性對照病毒株選用本實驗室分離的大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小劑量抽提試劑盒的說明書提取組織和細胞分離病毒的DNA。

根據GenBank已發表的蛙病毒屬的代表種FV3主衣殼蛋白（MCP）基因高度保守區序列（登錄號：AY548484）設計引物用于檢測，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

總體積為25 μL的反應體系為：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反應條件為：95 ℃預處理3 min，進行30個循環，每個循環反應包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統拍照，病鯢病毒提取液檢測結果呈陽性，確定患病大鯢為虹彩病毒（CGSIV）感染，見圖3。

經過流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，該養殖場發生的以大鯢體表和四肢腫大、多處潰爛、充血、出血為特征的疾病，診斷為大鯢虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：標準病毒擴增結果；2：陰性對照；3：病鯢病毒提取液擴增結果。4 診斷結果圖3 結果與標準病毒株PCR檢測對比

5 防治措施

確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行嚴格隔離，對養殖場、養殖水體及養殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。對餌料魚用高錳酸鉀進行浸泡，對未患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，連續注射3次。對患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，注射量為0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，連續注射3次，期間再注射我們自制的中西藥結合的抗病毒藥物，注射量為2 mL/kg·次，連續注射三天。用藥一周后死亡數量逐漸減少。兩周后，已無死亡現象，發病的大鯢部分開始攝食，疫情得到了有效的遏制。

6 討論

該養殖場大鯢被確診為大鯢虹彩病毒感染，大鯢虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus中的一種，為雙鏈DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦發病，只能通過注射一些增強免疫和消炎的藥物，治標不治本，往往會給養殖戶帶來巨大的損失。要想遏制病毒病的發生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我們已經研制成功針對大鯢虹彩病毒的滅活疫苗。通過注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，可以有效預防大鯢虹彩病毒病的發生，降低養殖戶的養殖風險。

在對該養殖場發病大鯢進行病毒檢測時，我們選用的檢測方法有細胞擴增和PCR檢測兩種。通過細胞擴增檢測，即使很微量的病毒量也可以檢測出，但此方法只能確定是病毒感染而不能確定是那種病毒感染，而PCR檢測方法通過與已知標準病毒進行對照，可以確定感染病毒的具體種類，但此方法由于檢測過程較為繁瑣，常會出現“假陽性”或“假陰性”結果。通過兩種方法的結合使用，揚長辟短可以大大提高檢測虹彩病毒的準確性。

摘 要：2013年7月，陜西省漢中某大鯢養殖場發生以大鯢體表和四肢多處潰爛并伴有出血為特征的疾病，染病大鯢大量死亡。經臨床觀察、病理解剖及實驗室檢測，最后確診病原為大鯢虹彩病毒。通過采取綜合防治措施，養殖場大鯢疫情得到有效控制。

關鍵詞：大鯢虹彩病毒；診斷；防治

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，有很重要的科研價值及藥用和營養價值。近年來，隨著大鯢人工養殖不斷發展，各種疾病也不斷暴發，尤其是病毒性疾病，給養殖戶造成慘重的經濟損失。2013年7月，陜西省商洛市洛南縣某大鯢養殖場發生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、充血及出血為特征的疾病，經過臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，診斷病原為大鯢虹彩病毒。現將診治結果報道如下。

1 基本情況及臨床癥狀

2013年7月，陜西省商洛某大鯢養殖場大鯢突發異常，行動緩慢，攝食減少，前、后肢嚴重腫脹、潰爛且局部出血，采用肌肉注射青霉素和慶大霉素、頭孢噻吩以及中藥浸泡等治療措施均無效，并在治療過程中陸續死亡，且隨著時間的推移，死亡數量越來越大。

2 病理剖檢

對病死大鯢進行病理剖檢，其結果如下：病死大鯢頭部、前、后肢、尾部嚴重潰爛、腫脹，頸部、腹部、下頜均有大量出血點，腹腔內有淡黃色的積水，肝臟腫大且松軟無彈性，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大有白點。

3 實驗室檢測

3.1 患病大鯢虹彩病毒的細胞擴增檢測

取病死大鯢的肝、腎組織各0.5 g于研磨器中加入2 mL無菌水在低溫下研磨制成懸液，轉移至15 mL離心管，放入-80 ℃反復凍融3次，然后轉移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為病毒提取液備用。取一瓶已培養了48 h的EPC細胞，棄去培養液，吸取0.2 mL病毒提取液接種到此培養瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培養液于25 ℃培養，同時做空白對照，24 h有CPE反應，72 h后CPE反應強烈，細胞已完全脫落，確定患病大鯢為病毒感染，見圖1和圖2。

3.2 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測

取前面已經制備的病毒提取液和陽性對照病毒株（陽性對照病毒株選用本實驗室分離的大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小劑量抽提試劑盒的說明書提取組織和細胞分離病毒的DNA。

根據GenBank已發表的蛙病毒屬的代表種FV3主衣殼蛋白（MCP）基因高度保守區序列（登錄號：AY548484）設計引物用于檢測，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

總體積為25 μL的反應體系為：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反應條件為：95 ℃預處理3 min，進行30個循環，每個循環反應包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統拍照，病鯢病毒提取液檢測結果呈陽性，確定患病大鯢為虹彩病毒（CGSIV）感染，見圖3。

經過流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，該養殖場發生的以大鯢體表和四肢腫大、多處潰爛、充血、出血為特征的疾病，診斷為大鯢虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：標準病毒擴增結果；2：陰性對照；3：病鯢病毒提取液擴增結果。4 診斷結果圖3 結果與標準病毒株PCR檢測對比

5 防治措施

確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行嚴格隔離，對養殖場、養殖水體及養殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。對餌料魚用高錳酸鉀進行浸泡，對未患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，連續注射3次。對患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，注射量為0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，連續注射3次，期間再注射我們自制的中西藥結合的抗病毒藥物，注射量為2 mL/kg·次，連續注射三天。用藥一周后死亡數量逐漸減少。兩周后，已無死亡現象，發病的大鯢部分開始攝食，疫情得到了有效的遏制。

6 討論

該養殖場大鯢被確診為大鯢虹彩病毒感染，大鯢虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus中的一種，為雙鏈DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦發病，只能通過注射一些增強免疫和消炎的藥物，治標不治本，往往會給養殖戶帶來巨大的損失。要想遏制病毒病的發生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我們已經研制成功針對大鯢虹彩病毒的滅活疫苗。通過注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，可以有效預防大鯢虹彩病毒病的發生，降低養殖戶的養殖風險。

在對該養殖場發病大鯢進行病毒檢測時，我們選用的檢測方法有細胞擴增和PCR檢測兩種。通過細胞擴增檢測，即使很微量的病毒量也可以檢測出，但此方法只能確定是病毒感染而不能確定是那種病毒感染，而PCR檢測方法通過與已知標準病毒進行對照，可以確定感染病毒的具體種類，但此方法由于檢測過程較為繁瑣，常會出現“假陽性”或“假陰性”結果。通過兩種方法的結合使用，揚長辟短可以大大提高檢測虹彩病毒的準確性。

摘 要：2013年7月，陜西省漢中某大鯢養殖場發生以大鯢體表和四肢多處潰爛并伴有出血為特征的疾病，染病大鯢大量死亡。經臨床觀察、病理解剖及實驗室檢測，最后確診病原為大鯢虹彩病毒。通過采取綜合防治措施，養殖場大鯢疫情得到有效控制。

關鍵詞：大鯢虹彩病毒；診斷；防治

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，有很重要的科研價值及藥用和營養價值。近年來，隨著大鯢人工養殖不斷發展，各種疾病也不斷暴發，尤其是病毒性疾病，給養殖戶造成慘重的經濟損失。2013年7月，陜西省商洛市洛南縣某大鯢養殖場發生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、充血及出血為特征的疾病，經過臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，診斷病原為大鯢虹彩病毒。現將診治結果報道如下。

1 基本情況及臨床癥狀

2013年7月，陜西省商洛某大鯢養殖場大鯢突發異常，行動緩慢，攝食減少，前、后肢嚴重腫脹、潰爛且局部出血，采用肌肉注射青霉素和慶大霉素、頭孢噻吩以及中藥浸泡等治療措施均無效，并在治療過程中陸續死亡，且隨著時間的推移，死亡數量越來越大。

2 病理剖檢

對病死大鯢進行病理剖檢，其結果如下：病死大鯢頭部、前、后肢、尾部嚴重潰爛、腫脹，頸部、腹部、下頜均有大量出血點，腹腔內有淡黃色的積水，肝臟腫大且松軟無彈性，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大有白點。

3 實驗室檢測

3.1 患病大鯢虹彩病毒的細胞擴增檢測

取病死大鯢的肝、腎組織各0.5 g于研磨器中加入2 mL無菌水在低溫下研磨制成懸液，轉移至15 mL離心管，放入-80 ℃反復凍融3次，然后轉移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為病毒提取液備用。取一瓶已培養了48 h的EPC細胞，棄去培養液，吸取0.2 mL病毒提取液接種到此培養瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培養液于25 ℃培養，同時做空白對照，24 h有CPE反應，72 h后CPE反應強烈，細胞已完全脫落，確定患病大鯢為病毒感染，見圖1和圖2。

3.2 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測

取前面已經制備的病毒提取液和陽性對照病毒株（陽性對照病毒株選用本實驗室分離的大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小劑量抽提試劑盒的說明書提取組織和細胞分離病毒的DNA。

根據GenBank已發表的蛙病毒屬的代表種FV3主衣殼蛋白（MCP）基因高度保守區序列（登錄號：AY548484）設計引物用于檢測，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

總體積為25 μL的反應體系為：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反應條件為：95 ℃預處理3 min，進行30個循環，每個循環反應包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統拍照，病鯢病毒提取液檢測結果呈陽性，確定患病大鯢為虹彩病毒（CGSIV）感染，見圖3。

經過流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，該養殖場發生的以大鯢體表和四肢腫大、多處潰爛、充血、出血為特征的疾病，診斷為大鯢虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：標準病毒擴增結果；2：陰性對照；3：病鯢病毒提取液擴增結果。4 診斷結果圖3 結果與標準病毒株PCR檢測對比

5 防治措施

確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行嚴格隔離，對養殖場、養殖水體及養殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。對餌料魚用高錳酸鉀進行浸泡，對未患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，連續注射3次。對患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，注射量為0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，連續注射3次，期間再注射我們自制的中西藥結合的抗病毒藥物，注射量為2 mL/kg·次，連續注射三天。用藥一周后死亡數量逐漸減少。兩周后，已無死亡現象，發病的大鯢部分開始攝食，疫情得到了有效的遏制。

6 討論

該養殖場大鯢被確診為大鯢虹彩病毒感染，大鯢虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus中的一種，為雙鏈DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦發病，只能通過注射一些增強免疫和消炎的藥物，治標不治本，往往會給養殖戶帶來巨大的損失。要想遏制病毒病的發生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我們已經研制成功針對大鯢虹彩病毒的滅活疫苗。通過注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，可以有效預防大鯢虹彩病毒病的發生，降低養殖戶的養殖風險。

在對該養殖場發病大鯢進行病毒檢測時，我們選用的檢測方法有細胞擴增和PCR檢測兩種。通過細胞擴增檢測，即使很微量的病毒量也可以檢測出，但此方法只能確定是病毒感染而不能確定是那種病毒感染，而PCR檢測方法通過與已知標準病毒進行對照，可以確定感染病毒的具體種類，但此方法由于檢測過程較為繁瑣，常會出現“假陽性”或“假陰性”結果。通過兩種方法的結合使用，揚長辟短可以大大提高檢測虹彩病毒的準確性。