高等院校農林專業基因工程實驗教學改革探索與實踐

段永波，趙豐蘭，宋運賢，盛 瑋，薛建平(淮北師范大學生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北235000)

作為生命科學的重要組成部分，基因工程與細胞工程、酶工程和蛋白質工程在分子、細胞、酶學、蛋白水平共同組成了現代生物工程。其通過將所需的生物遺傳物質——脫氧核糖核酸(DNA)從供體生物分離出來，用適當的限制性內切酶進行切割后連接至表達載體，將重組質粒導入受體細胞并整合至其基因組，使得目標基因在受體細胞內復制、轉錄和翻譯，進而發揮其功能。自上世紀70年代誕生以來［1］，基因工程已廣泛應用于醫學、農業、工業和環保等各領域，在推動現代生命科學的發展中發揮了非常重要的作用。

目前，基因工程已作為生物科學和生物工程專業的一門核心專業基礎課，在綜合性大學、農業大專院校、師范和醫科大學等各類高校陸續開設。該課程的整條主線都是基于DNA水平的操作，基本屬于“無實物”教學，給課程學習帶來了很大難度。因此，基因工程實驗就成了非常必要的輔助課，也是引導學生將理論知識應用于實踐，培養科學分析思維能力和創新能力的一門方法學課程。因其要求學生具備生化及分子生物學基本知識和操作技能，單個試驗中間有時間間隔，實驗周期較長，涉及昂貴儀器和試劑的使用，給課程教學帶來很大挑戰。

傳統的基因工程實驗技術教程主要集中于基因克隆與重組質粒的構建與驗證［2］，所開設實驗常涉及一整套該課程實驗技術，包括培養基配制和高壓滅菌等常規實驗。原來該課程教學目的主要是驗證基因工程操作原理，在創新研究方面的內容不多。此外，驗證性的實驗結果難以帶給學生創造性的“成就感”，實驗過程多是填鴨式的被動完成。這會導致學生完全機械性地“做實驗”，以致教學效果不佳。為提高教學效果，培養實踐技巧和科學思維能力，針對高等院校農林專業特點，筆者將系統工程與模塊化設計相結合，應用于該課程教學并取得很好的教學效果。

1 課程建設思路與設計

該課程在淮北師范大學主要針對師范專業學生開設，多數學生在畢業后將從事高中生物教學。近年來，基因工程及分子生物學實驗設計在高考中占有非常重要的地位。在開設此門課程之前，學生已經累積了微生物學、遺傳學、分子生物學等課程及其相應的實驗技術。因此，該課程建設旨在保證學生在完全理解基因工程內涵的基礎上，進一步培養學生的科研態度和創新思維。

該課程僅保留基因工程實驗課程中“分、切、接、轉、篩”的經典內容［3］，在有限的課時內完成了從目的基因克隆到載體構建過程，并實現所構建載體在植物中表達的整個過程。基于傳統實驗課程中所獲結果直觀性不強的缺點，筆者在教學中引入了啟動子、報告基因和終止子3個元素，通過從植物基因組DNA中克隆啟動子、相關質粒中擴增報告基因連接至表達載體，并實現其在植物細胞中表達，讓學生完成從基因水平到蛋白表達水平整個過程，同時檢測報告基因表達，直觀地感受實驗的魅力，提高教學效果。

整體實驗流程設計劃分為3個相對獨立的模塊，每個模塊都可獨立考核，其后也能放置較長時間至下一個實驗(圖1)。整個課程中學生將完成基因表達所需元件中啟動子和基因的功能分析。同時，以水稻或玉米2中植物作為實驗材料克隆啟動子，還提供含β－1，4糖苷酶gus的大腸桿菌供克隆報告基因。讓學生提前查詢資料熟悉引物設計的原則及方法，親自設計PCR引物(包括在引物末端添加酶切位點)，掌握報告基因gus作用機理，并根據自身興趣選擇實驗材料，進而提高其完成實驗的主動性。

2 教學方案實施

圖1 整體教學設計流程

筆者以基因表達框為出發點，以報告基因為研究對象，改變了傳統基因工程實驗課程中實驗結果主要以電泳圖譜的單一形式呈現的缺點，將實驗最終結果以報告基因在植物細胞中的表達檢測來呈現。同時，將系統工程和模塊化設計思路引入課程教學，形成整個課程于一個完整實驗，又將其劃分為3個獨立模塊，既提高了學生對實驗的興趣，又解決了實驗課時間安排的難題。采用小班教學模式，分2人一小組，保證師生間充分交流及學生對實驗的充分理解。

在介紹實驗整體流程時，根據實驗內容創造問題情景，引導學生實驗前查詢所設置問題可能出現的原因及解決辦法。比如:研究水稻及玉米等作物基因工程技術的目的、意義及發展方向，報告基因gus作用機理，電泳中EB染色原理，基因克隆及載體構建過程中的難點，農桿菌介導基因轉化植物細胞的原理等。

整個實驗課程均始終貫穿以學生為主，教師為導的教學思想。目前表達載體構建中質粒DNA提取、酶切、連接等操作都有相應的試劑盒，因此將課程重點由原來的克隆驗證轉到從目標基因克隆直至在真核細胞中的表達上。

在開始各實驗單元模塊前，介紹實驗原理及操作步驟，同時引出相應的問題供學生討論。在目的基因PCR擴增實驗中，引導學生對其所選植物研究意義進行討論，最后教師總結，指出采用基因工程技術改良玉米和水稻等重要農作物對保障人類糧食安全的重要意義。同時在PCR和酶切實驗間歇增加了電子克隆知識介紹、引物設計方法及如何通過酶切位點實現基因工程中的“剪切—拼接”過程，采用多媒體展示現代生物學知識發展的日新月異。這樣即可將學生興趣、理論知識和實踐很好地結合，使學生加深對實驗的理解，提高教學效果。

筆者以表達報告基因gus為目標，讓每組同學都克隆啟動子和目的基因這2個表達框中的重要元件，并在生菜中瞬時表達。提供給學生由筆者構建的含有gus但無啟動子的載體pCAMBIA1381，以及有CaMV35S啟動子但不含報告基因的載體pCAMBIA1305.1。將所構建的啟動子及報告基因功能分析的載體導入農桿菌，瞬時轉化生菜，會得到2組對照載體及上述所構建載體。通過報告基因表達分析會得出這樣的結果:只有啟動子或報告基因都不能表達，必須要2個元件同時存在才能檢測到外源基因表達。結合實驗過程中介紹的基因內含子及表達框中終止子功能，學生即可直觀地理解基因表達框中各個元件的作用。

鼓勵學生以科技論文的形式完成實驗報告，包括題目、作者姓名、摘要、引言、材料與方法、結果與分析、討論、參考文獻等內容，重點注意結果分析與討論部分，以此加深對實驗的理解。強調實驗報告是課程考核的重要部分，實驗操作完成不夠理想的學生也可以在此環節獲得好成績。

3 結語

基因工程實驗課程涉及實驗內容多、周期長、實驗結果感官性不強，給學生和教師都帶來了很大挑戰。筆者以基因表達框為基礎，引入啟動子和報告基因2個元件，不僅讓學生同時完成2個元件的克隆及其各自在基因表達中的作用，還避免了外源蛋白檢測所需的蛋白抽提和Western blot等復雜且不易控制的操作。課程完成后，采用雙向選擇的方式引導學生參與基因工程技術方向的畢業設計與實踐。很多學生將該課程所學知識應用到畢業論文中，也培養了學生的科學思維方法。

基因工程技術更新極快，但每項技術發明后生物技術公司就會在很短時間內研制并發布相應操作規程，因此未來基因工程實驗技術的主要目標應該轉向培養學生的創新創造能力。在今后課程改革中，筆者將嘗試以科研課題為載體，進一步加深基因工程實驗課程與學生畢業論文設計的結合，拓寬學生科研思維，以助于其今后從事教學、科研等工作。

［1］JACKSON D A，SYMONS R H，BERG P.Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40:circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli［J］.PNAS，1972，69(10):2904 －2909.

［2］盛小禹.基因工程實驗技術教程［M］.上海:復旦大學出版社，1999.

［3］J·薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2002.