夾竹桃葉片水提液對細菌的抑制作用

翟 興 禮

(商丘師范學院 生命科學學院，河南 商丘 476000)

夾竹桃(Nerium indicum)，又名柳葉桃、半年紅，屬夾竹桃科，夾竹桃屬.具有抗煙霧、抗灰塵、抗毒物和凈化空氣、保護環境的能力.夾竹桃是最毒的植物之一，包含多種毒素，有些甚至致命.夾竹桃很少有病蟲害，而且其葉、枝、根都可以用于殺蟲［1］.夾竹桃全株有毒，其毒性成分主要是強心甙類物質(異熱馬酮、煙酰異熱馬酮、洋地黃毒甙元、厚果酮等).熊英年等曾利用夾竹桃治療畜禽寄生蟲病300 多例［2］.還發現夾竹桃提取液能用于消滅釘螺［3］以及抑制茭白二化螟［4］和線蟲［5］的生物活性.

研究發現，夾竹桃對一些細菌具有抑菌作用.李萍、譚蕓、龔枕等曾利用夾竹桃研究其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等受試菌種的抑菌作用，結果表明其均有不同程度的抑菌作用［6］.陸寧海、吳利民、李曉紅等以玉米小斑病菌、小麥紋枯病菌等植物病原菌作為受試菌種，研究夾竹桃的抑菌性，實驗結果表明其對植物病原菌具有抑菌作用［7］.本實驗以巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌作為受試菌種，采用濾紙片貼片法實驗，以產生的抑菌圈直徑大小作為抑菌效果大小的衡量尺度，進行夾竹桃葉提取液的抑菌作用研究.以期為夾竹桃的充分、合理的開發利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 夾竹桃葉的選取

一般于5月下旬至6月中旬，取夾竹桃枝條上部嫩葉片或枝條頂端嫩芽，汁液較多也方便磨碎.試驗用夾竹桃采自商丘師范學院中心花園.

1.1.2 供試菌種

巨大芽孢桿菌(bacillus megatherium)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)，購于中國農業科學院.

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂粉).

1.1.4 實驗儀器

高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養箱，電子天平，研缽，三角瓶，小試管，培養皿，圓形濾紙片(6 mm)等.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制

牛肉膏蛋白胨培養基［8］:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL，pH 7.4－7.6.將各種物質加入水中加熱溶解后，分裝于5 個250 mL 的錐形瓶中，滅菌后備用.

1.2.2 夾竹桃葉提取物的制備

取夾竹桃葉，用自來水洗凈后用蒸餾水沖洗，晾干頁面水分，稱取15 g 于紫外燈下照射20 min［12］.放入滅菌后的研缽中，放適量石英砂于其中，研磨后，加5 mL 無菌蒸餾水浸泡1 h.用四層無菌紗布過濾并擠壓，即得夾竹桃提取液.

夾竹桃水提取液的濃度=夾竹桃葉的質量(鮮重)/葉重+加入水的體積，此時該提取液濃度為75 %.再將75 %的夾竹桃用無菌蒸餾水稀釋成50 %，25 %，5 %三個濃度，即得到75 %、50 %、25 %、5 %四個提取液濃度梯度，置于冰箱中保存備用.

1.2.3 提取液濾紙片浸制

將經過干熱滅菌的小濾紙片(6 mm)分別放入各濃度的夾竹桃葉提取液中，充分浸泡2 h.

1.2.4 受試菌液的配制

將低溫保藏的巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌進行斜面活化24 h.分別用接種環挑取四環活化后的菌落，加入裝有10 mL無菌水的小試管中，充分震蕩使菌體散開，制成菌懸液備用.

1.2.5 抑菌實驗

分別用加液槍取兩種菌懸液0.5 mL 加入到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，用涂布棒涂勻.正置30 min 后，將用各濃度夾竹桃提取液浸泡后的濾紙片小心均勻放置到帶菌的培養基平板上，每皿放相同夾竹桃葉提取液濃度的4 片濾紙.每個濃度提取液做3 個重復實驗;對照組兩種菌種各做1 個.放入37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24－48 h，觀察有無抑菌圈出現，測量抑菌圈直徑大小，求其平均數.

2 結果與分析

以巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌為受試菌種，利用4 個濃度梯度的夾竹桃葉提取液來進行抑菌實驗，測量抑菌圈直徑大小，具體抑制情況見表1.

表1 夾竹桃葉提取液對巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 Circle diameter of Bacteriostasis effert of water extract from Oleander Leaves on bacillus megatherium

抑菌實驗的結果顯示，4 個濃度的夾竹桃葉提取液對巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均有不同程度抑制作用.高濃度的提取液具有明顯的抑菌圈出現，抑菌效果明顯;隨著其濃度的降低，抑菌圈的直徑減小，抑菌程度減弱.

根據以上實驗結果，夾竹桃葉提取液對巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均具有殺菌作用.75%的夾竹桃葉提取液對巨大芽孢桿菌的最大抑菌圈直徑為10.25 mm，對枯草芽孢桿菌的最大抑菌圈直徑為9.0 mm，較前者小一些，比較夾竹桃葉提取液對兩種受試菌種的抑制作用，其對巨大芽孢桿菌的抑制圈均比對枯草芽孢桿菌的抑菌圈大;這表明，相同濃度的夾竹桃葉提取液對巨大芽孢桿菌的抑菌效果要比對枯草芽孢桿菌的要高一些.

3 討論

對于夾竹桃的抑菌作用研究，李昌靈、牛友芽、劉勝貴曾用不同溶劑進行夾竹桃葉提取液的抑菌實驗;結果表明，夾竹桃葉的70%乙醇提取液的抑菌效果最為明顯［9］.同時，譚宏亮、黎鵠志將夾竹桃葉進行加熱干燥后，蒸餾水煮沸提取，濃縮后制得提取液進行抑菌實驗，也收得較好的實驗結果［10］.本實驗以蒸餾水直接浸泡提取夾竹桃有效成分，進行抑菌實驗，具有一定的抑菌性;但較之李昌靈、牛友芽、劉勝貴所做的實驗結果相比，抑菌效果較差.說明不同提取方式對夾竹桃有效成分的提取效果不同.蒸餾水直接提取效果不佳，可能是用水直接提取有效成分不能充分提取出來，進而造成抑菌效果不理想.

夾竹桃以其劇毒性，在殺蟲殺菌方面具有較大作用.同時其有效成分具有治療心臟病、心力衰竭、閉經的作用.生物體內的免疫系統非常復雜，因此一種藥物對機體的殺菌作用效果及殺菌機理都有待進一步進行體內實驗研究.本實驗是進行的體外實驗，為夾竹桃的進一步開發利用提供理論依據.

［1］沈宦初，張一賓.生物農藥［M］.北京:化學工業出版社，2000.

［2］熊英年，張吉英，李德山.夾竹桃的殺蟲作用［J］.中獸醫學雜志，1997(4):41.

［3］曾永鋼，唐萬鵬，胡興宜等.釘螺對夾竹桃強心總甙毒理作用的反應［J］.科技創新導報，2010(19):128－129.

［4］鄭許松，俞曉平，呂仲賢，等.夾竹桃葉提取物對茭白二化螟的生物活性［J］.浙江農業學報，2003，15(3):167－171.

［5］王猛，曹福祥，滕濤.夾竹桃提取物對松材線蟲致死性的研究［J］.湖南林業科技，2000，33(6):7－8.

［6］李萍，譚蕓，龔枕，王智.夾竹桃葉提取液的抑菌作用研究［J］.湖南農業科學，2009(11):94－95.

［7］陸寧海，吳利民，李曉紅，等.夾竹桃抑菌活性的初步研究［J］.湖北農業科學，2007，46(6):934－935.

［8］沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學實驗(第三版)［M］.北京:高等教育出版社，2006.57－58，100－103.

［9］李昌靈，牛友芽，劉勝貴.夾竹桃葉提取物的抑菌作用研究［J］.安徽農業科學，2008，36(2):575－577.

［10］譚宏亮，黎鵠志.夾竹桃葉水提取物抑菌作用研究［J］.宜春學院學報，2007，29(4):70－71.