烯效唑時間分辨免疫分析方法研究

摘要：基于多克隆抗體建立了烯效唑的時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

關鍵詞：烯效唑；多克隆抗體；時間分辨免疫分析

Time-resolved Fluoroimmunoassay for the Detection of the Uniconazole

HONG Xia1，2*，XING Hai-long2，WANG Chenchen2

（1.School of the Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2.Jiangsu wise science and technology development Co.LTD，Zhenjiang 212009，Jiangsu，China）

Abstract：A sensitive time-resolved fluoroimmunoassay（TRFIA）based on polyclonal antibody for detection of uniconazole was developed. A hapten was synthesized and conjugated with ovalbumin（OVA）as the coating antigen. The coating antigen was coated by physical adsorption onto a 96 well microtitre plate，which was then competed with uniconazole in the sample for limited quantity of anti-uniconazole antibody labeled by Eu3 +.Uniconazole in the samples could be determined by direct competition method. At spiked different levels （0.05～0.5 mg/kg in water and soil） recoveries of uniconazole were from 80.4%～116.8%， with CV of 2.6%～8.7%. The TRFIA could be a convenient tool for monitoring uniconazole residues in environment and food samples.

Key words：uniconazole；polyclonal antibody；TRFIA

烯效唑，屬三唑類化合物，是80年代日本住友化學公司推出的高活性的植物生長延緩劑和殺菌劑。烯效唑延緩作物生長的作用機制在于它能有效的抑制植物體內赤霉素（GA）的生物合成，減少體內乙烯含量，增加細胞分裂素（CTK）含量，提高體內CTK/IAA的比例，從而使這些內源激素調控的生理效應發生相應的變化[1]。烯效唑常用于大田作物、果樹、蔬菜、煙草、花卉等眾多植物，活性高于多效唑，同時毒性較低，被廣泛用于農業、園藝植物生產中[2]。

隨著人們對環境與食品安全關注程度逐漸加大，迫切需要建立快速靈敏的檢測烯效唑殘留的分析方法。烯效唑殘留測定方法主要是高效液相色譜（HPLC）[3]和氣相色譜（GC）[4]，這些方法前處理比較繁瑣，檢測結果受樣品凈化、濃縮等步驟的影響，不適合進行批量樣品的快速檢測，而免疫學技術在農藥殘留分析和環境監測中的應用越來越深入，已成為農藥殘留分析的重要方法之一。抗烯效唑農藥的多克隆抗體的酶聯免疫分析技術（ELISA）也有報道[5]，但是檢測靈敏度不高。時間分辨免疫分析技術具有高靈敏性、高選擇性、快速等優點，可以彌補普通ELISA免疫分析技術靈敏度的不足。本研究制備了烯效唑半抗原和多克隆抗體，建立了烯效唑的TRFIA殘留檢測方法，為環境與食品中痕量烯效唑殘留高靈敏檢測提供技術支持。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.2包被原的合成

1.3固相包被板的制備

1.5添加樣品的處理 河水經過濾，添加0.05～0.5mg/L的烯效唑標樣，用甲醇的PBS稀釋，進行測定。稱取10g土壤，添加0.05～0.5mg/kg的烯效唑標樣，混勻，放置過夜，加入40ml二氯甲烷，超聲10min，4000r/min離心10min，取上清液20ml于圓底燒瓶中減壓濃縮，用含甲醇的PBS定容到10ml。每個處理設3個重復，各設一個空白對照，用建立的TRFIA法對樣品進行分析。

1.6測定

2 結果與分析

2.1包被原的鑒定 對半抗原、載體蛋白及偶聯物進行全波長掃描見圖1，偶聯物的紫外吸收光譜發生了明顯的變化，具有載體蛋白和半抗原的紫外吸收特征。根據它們在280nm波長下的摩爾吸光系數估算得到包被原的結合比為7：1。

圖1 半抗原、卵清蛋白及偶聯物的紫外吸收光譜

圖2 烯效唑TRFIA標準曲線

2.4抗體的特異性 用TRFIA在相同的條件下測定與烯效唑結構相似化合物對抗體的交叉反應，計算各自的抑制中濃度IC50和交叉反應率CR（表1），結果表明得到的抗體對烯效唑有較好的選擇性，對大部分三唑類殺菌劑沒有明顯的交叉反應。

2.5回收率測定 添加不同濃度的的烯效唑標樣在河水和土壤中，按照TRFIA進行測定，檢測結果見表2。在水和土壤中分別添加烯效唑標準溶液，平均回收率為80.4%～116.8%，變異系數為2.6%～8.7%，符合農藥殘留檢測要求，符合農藥殘留檢測要求。

3 討論

本文采用TRFIA技術進行烯效唑檢測。其靈敏度（IC50）較ELISA[5]成倍增加，分析靈敏度可達到0.2mg/L，靈敏度提高了一個數量級。可見TRFIA法檢測烯效唑比ELISA法靈敏度上具有明顯優勢。TRFIA具有獨特的熒光特性，特異性熒光的衰變時間極長，為傳統熒光的103～106倍，激發光與發射光之間的Stokes位移可達290 nm，而普通熒光素的Stokes位移僅為28nm[6-9]，使得試劑標準曲線飄移小，更提高了試劑的穩定性和準確性。本文在研究過程中還發現，標記抗體和Eu3 +的標記量的控制非常重要，它們的量直接影響靈敏度和本底值。研究發現：低濃度標記抗體，標記效率高，但本底高；高濃度標記抗體，有助于提高靈敏度和降低本底，但其標記效率有所下降。

綜上所述，本文建立的烯效唑-TRFIA法，具有靈敏度高和重復性好等優點，能夠滿足環境與食品中痕量烯效唑的檢測需求，具有良好的應用價值。

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