細胞凋亡檢測方法的研究進展

摘要：本文綜述了細胞凋亡的各種檢測方法的原理及應用范圍，并分析了各自的優點及局限性。應選擇適當的細胞凋亡檢測方法進行綜合檢測，得到較為準確的結果。

關鍵詞：細胞凋亡；檢測方法；分析評價

細胞凋亡（apoptosis）是細胞在一定的生理或病理狀態下，遵循自身的程序，自己結束自己生命的過程。細胞凋亡不受到外部損傷因素直接導致的被動改變而屬機體自身的生理活動，是由基因控制的、高度有序的細胞主動死亡過程，即程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）[1]。它貫穿從受精、發育、成熟、衰老的整個生命過程，近年來一直是生命科學和醫學領域各專業的研究熱點。隨著研究細胞凋亡的方法不斷涌現和深入，分析手段日趨完善和成熟。現將細胞凋亡檢測方法歸納如下。

1 形態學檢測

細胞凋亡是形態學名稱，其特征性改變包括細胞漿固縮、體積縮小、細胞皺縮以及細胞核致密等。一般認為形態學變化是判斷有無細胞凋亡的基礎[2]。根據凋亡細胞固有形態特征，人們設計了多種不同的細胞凋亡形態學檢測方法，常用的有：普通顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察、透射電子顯微鏡規察。普通光學顯微鏡只可以觀察到細胞凋亡的大體形態胞膜起泡現象和凋亡小體。但凋亡細胞的形態學變化大多發生在超微結構，因此用光鏡觀察難以令人滿意。通過電鏡可以觀察到有典型的凋亡細胞出現，其特征是細胞核體積縮小，染色質濃縮致密，并沿核膜分布形成新月體狀，細胞膜微絨毛消失，但細胞漿內的各種細胞器基本正常。凋亡細胞的典型形態改變在透射電鏡下能夠得到最佳的體現，為凋亡細胞判定提供了最可靠的依據。電鏡檢測細胞凋亡的缺點是：只能定性，不能定量；樣本制作處理過程復雜，設備相對昂貴，對檢查者的技術水平要求較高[3-4]。

2 DNA片段化檢測

2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測法 細胞凋亡時，DNA在內源性核酸內切酶的作用下.在核小體間被切割成180～200 bp整數倍的單核苷酸片段。DNA裂解是標志細胞最終走向死亡的不可逆的重要過程。正常活細胞的DNA凝膠電泳為一條區帶；而當細胞凋亡時，由于DNA被裂解成單核小體和寡聚核小體，電泳時呈現特征性的\"階梯狀\"（1adder）條帶；而壞死細胞的DNA斷裂為無特征的雜亂片斷，利用此特征，既可確定細胞的凋亡，又可與壞死細胞區別。因此DNA凝膠電泳一度被認為是判定細胞凋亡的金標準之一[5]。這種檢測方法簡便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，靈敏性不高，但在作群體細胞凋亡分析時具有一定意義。本方法被廣泛應用于作群體細胞凋亡分析中[6]。

2.2 EILSA法分析組蛋白 細胞凋亡的發生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進入核小體間切割DNA，產生180bp～200bp或其倍數的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復合物而不被核酸內切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結構，可特異性檢測細胞溶解物中的核小體片段。此法具有需要設備簡單.敏感性高，所需細胞個數少等優點。其缺點是不能精確測定凋亡發生絕對量和提供細胞的組織學定位。試驗過程中如果裂解細胞的時間過長可能導致細胞核中的DNA片段也被計算在內，進而導致結果偏高，因此不同的細胞系需要經過數次摸索才能確定最佳檢測條件[7]。

2.3 DNA片段原位標記法

2.3.1.原位缺口轉移（in situ nick-translation，ISNT）技術 細胞發生凋亡時，核酸內切酶在DNA分子中導入切口，DNA多聚酶在切口部位表達外切酶活性，使核苷酸自5'向3'方向切去；同時以切口部位末端核苷酸的3'一OH為引物，利用DNA多聚酶I的聚合活性將未標記的核苷酸用標記的核苷酸進行置換，切口沿DNA分子移動，同時水解5'末端，以修復DNA原位切口平移技術將標記的核苷酸引入凋亡細胞的DNA，據此可檢測凋亡細胞。

3 流式細胞儀檢測法

流式細胞儀（FCM）是將流體噴射技術、激光光學技術、電子技術和計算機技術等集為一體，用于細胞定量分析和進行細胞分類研究的工具。此方法系通過熒光素如PI、hoechst 等親DNA的特性，分析懸浮細胞中DNA 含量的直方圖來判斷細胞凋亡。①PI 染色法：凋亡細胞經PI 染色、流式細胞儀檢測，在正常細胞G1期的峰前增加1個特異性亞二倍體峰（sub-G1峰）俗稱\"凋亡峰\"。通過FCM測定DNA的含量還可以研究凋亡細胞的周期特異性。此方法的優點是可定量檢測，靈敏度高。缺點是不能觀察S期和G2期凋亡的細胞，不能區別壞死細胞和凋亡細胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI 法的不足。hoechst被活細胞攝取后與DNA結合呈藍色熒光；PI使壞死細胞呈紅色熒光。因此，在直方圖上可根據紅藍兩種熒光判斷3種細胞：正常細胞呈弱藍、弱紅光；凋亡細胞呈強藍、弱紅光；壞死細胞呈弱藍、強紅光[9]。③Annexin V/PI法：在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（Ps）遷移至細胞膜外側。PS發生的變化即外露早于DNA斷裂，早于染色質凝集及凋亡小體的形成，外露后成為免疫系統識別的標志，能與高親和力的鈣依賴性的磷脂結合蛋白Annexin V結合，將Annexin V進行熒光素（FITC、PE、ECFP）標記可以檢測細胞凋亡，是最敏感的指標之一，但壞死細胞Ps亦暴露于外表使Annexin V結合陽性，因此使用Annexin V這一參數不能區分壞死或凋亡，必須同時結合PI進行凋亡細胞雙染后用流式細胞儀即可將凋亡細胞以及壞死細胞區分開來。結果判斷正常活細胞Anmxin-V、PI均低染；凋亡細胞Anmedn-V高染、PI低染；壞死細胞Anmxin-V、PI均高染。利用Annexin V/PI法，是目前檢測細胞凋亡最理想的方法。

4 細胞凋亡相關物質的檢測

4.1 酶學檢測

4.1.1 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases-3）活性檢測 細胞凋亡過程中有許多蛋白酶參與并相互協調以促進凋亡的發生。在凋亡的起始和執行過程中起關鍵作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）。大多數凋亡都涉及Caspase-3的活化，它是關鍵的凋亡執行分子.Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡早期階段被激活它通過分解去除DNA酶的一個負調節亞基而問接使之活化，實現了DNA的片段化，最終發生細胞凋亡。常采用熒光分光光度計檢測其活性。因活化的Caspase-3能夠特異切割DIE2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵，故設計出熒光物質偶聯的短肽Ac_DEVDAMC。短肽被水解后釋放出的AMC能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度大小，可測定Caspase-3活性，從而反映Caspase-3的活化度，以判斷細胞凋亡程度[10]。

4.1.2 乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是主要存在于神經系統的一種水解酶，其經典功能是水解神經遞質乙酰膽堿從而終止神經沖動的傳遞[11]。張學軍等[12 ]發現乙酰膽堿在細胞凋亡追蹤起重要作用，他們以人肺成纖維細胞株、NIH/3T3小鼠、HEL、PC-3和牛肉皮細胞等為材料，用衰老凋亡或化療藥物誘導法誘導細胞凋亡，綜合流式細胞術、DNA電泳、形態學及TUNEL等方法檢測凋亡細胞，發現各類細胞在正常狀態下無AchE活性反應。一旦發生凋亡，均具有AchE活性反應，從而建立了這一檢測凋亡細胞的新方法[13]。酶學檢測簡單、快速、方便，適合大量培養細胞的凋亡檢測，但不能定量和定位。

4.2 細胞凋亡相關基因水平的檢測 在細胞凋亡時有些基因表達異常，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas蛋白結合受體后形成死亡介導信號復合體（DISC），能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞等靶細胞調亡[14]。Bcl-2和Bcl-XL作為抗凋亡的調節物，它們的表達水平比例決定細胞是凋亡還是存活[15]。現多采用Northern雜交和RT-PCR對它們進行檢測，隨著近年來熒光定量PCR技術的發展，用定量PCR來檢測基因表達水平較前者更快更準確。

總之，目前檢測細胞凋亡的方法很多，但都有其自身的優點和局限性。應充分了解各種檢測方法的原理及應用范圍，根據標本綜合選擇幾種適當的方法進行檢測，常可得到較準確結果。在進行細胞凋亡檢測的時候，要幾種方法進行檢測，避免使用單一方法。例如：電鏡觀察仍是確定凋亡的最具權威的標準.因此在凋亡定量控測之前應先行電鏡觀察定性；PI染色流式細胞檢測法漏檢率及錯檢率均高.不適于凋亡定量觀察.但其方法簡便、價廉，適用于大批標本的篩選預試驗；TUNEL法是目前最常用的凋亡檢測技術.為避免壞死細胞的影響，應先用熒光鏡檢以保證TUNEL染色細胞不存在壞死細胞，否則應另選其它檢測方法。

綜上所述，只有幾種不同的檢測方法進行綜合檢測得到的結果，才能真正的反映細胞發生凋亡的情況，進而準確的對其凋亡進行定性和定量判定。相信伴隨著人類對凋亡機制更加深入的了解，操作簡單、敏感性高、成本低廉的細胞凋亡檢測方法會越來越多，也將對基礎細胞生物學，生物醫學及臨床某些疾病的診斷及治療產生深遠影響。

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