基于呼吸代謝系統動態監測慢性心衰（心陽虛證）大鼠模型的建立及評價*

侯衍豹尹翠翠，2高 敏楊 勇，3△容 蓉

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省泰安腫瘤防治院，山東 泰安 271000；3.山東省經方研究重點實驗室，山東 濟南 250355）

·研究報告·

基于呼吸代謝系統動態監測慢性心衰（心陽虛證）大鼠模型的建立及評價*

侯衍豹1尹翠翠1，2高 敏1楊 勇1，3△容 蓉1

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省泰安腫瘤防治院，山東 泰安 271000；3.山東省經方研究重點實驗室，山東 濟南 250355）

目的參考心陽虛慢性心衰的臨床表現，通過前期結扎冠狀動脈左前降支，后期給予一氧化氮合酶抑制劑（左旋硝基精氨酸）建立大鼠慢性心衰（心陽虛證）模型并給予評價。方法Wistar大鼠按體質量隨機分為假手術組、心陽虛慢性心衰模型組。冠脈結扎術后4周后，給予左旋硝基精氨酸（LNNA）4周致心衰發展模型，假手術組穿線不結扎。實驗過程中采用無創的呼吸代謝系統動態監測大鼠的呼吸代謝、能量代謝變化情況作為模型評價的依據；最后采用血流動力學檢測大鼠的心功能并及時記錄造模過程中大鼠的死亡情況，外觀體征、精神狀況、飲食、排泄及水腫等狀況。結果心陽虛慢性心衰模型組與假手術組比較，除第2周呼吸代謝及能量代謝較冠脈結扎初始增強明顯外，第6周到第8周呼吸代謝及能量代謝明顯減弱（P＜0.01）；模型組大鼠心率（HR）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左心室舒張所用時間（Tau）呈上升趨勢（P＜0.05）；左室內壓變化最大速率（±dp/dtmax）均呈降低趨勢（P＜0.01）。結論前期結扎冠狀動脈左前降支，后期給予一氧化氮合酶抑制劑（左旋硝基精氨酸），通過采用呼吸代謝系統可以動態監測模型動物的狀態和生理機能情況，可準確判斷出模型出現的時間窗，從而為慢性心衰（心陽虛證）模型建立提供一種客觀、無創的判斷方法。

心陽虛 慢性心衰 呼吸代謝 能量代謝 血流動力學

慢性心衰是一種嚴重的臨床綜合病，是心血管疾病最大的死因，其危害性已引起社會各界的廣泛關注。臨床上心衰后期以心腎陽虛、陽氣虛脫、血瘀痰凝水泛為主，嚴重威脅人類生命。近年來，中醫對心衰的病癥、病機及實驗與臨床的研究越來越重視，醫學界對慢性心衰的治療也取得較大進展。但是慢性心衰的發病仍呈現逐年上升趨勢，慢性心衰的防治意義重大。現有的慢性心衰（心陽虛證）動物模型造模方法雖然有多種方法［1］、但因為該模型復制的周期長、死亡率高、多因素造模，造成不同研究者之間模型復制差別很大；而且作為模型建立的重要因素--造模周期，常常是根據研究者的主觀判斷，或采用盲殺部分動物的方法來斷定。這就會造成模型復制重現性低，難以確定合適的造模時間窗口，并且也很難較好地體現陽虛的特點。因此，采用一種無創的監測手段來建立與臨床病癥相符的動物模型，對于探索慢性心衰（心陽虛證）的發病機制、病理改變及開發新的治療藥物及治療手段均具有重大意義。本研究根據慢性心衰（心陽虛證）的臨床表現，實驗過程中采用無創的呼吸代謝系統動態監測大鼠的呼吸代謝、能量代謝變化情況，通過前期結扎冠狀動脈左前降支，后期給予一氧化氮合酶抑制劑（左旋硝基精氨酸）的復合方法建立慢性心衰（心陽虛證）大鼠模型并給予評價。先報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，SPF級，雄性，22只，體質量200～250 g，由山東魯抗動物實驗中心提供，動物可證編號：SCXK（魯）20080002。飼養環境：室溫22～26℃，相對濕度40%～70%RH。

1.2 實驗儀器 BL-420E生物機能實驗系統 （型號BL-420E，成都泰盟科技有限公司）；小動物人工呼吸機 （DW3000-B，淮北正華生物儀器設備有限公司）；TSE LabMaster System（LabMaster-CaloSys德國TSE公司）；MPVS UltraTM壓力-容積分析系統 （澳大利亞powerlab公司）；Millar壓力容積導管SPR-838（美國Millar公司）。

1.3 實驗試劑 左旋硝基精氨酸 （購自Sigma公司，批號：101278121）；4%水合氯醛；注射用青霉素鈉（批號：B130316，山東魯抗醫藥股份有限公司）；0.9%氯化鈉注射液。

1.4 分組及造模 Wistar大鼠22只，按體質量隨機分為假手術組10只、心陽虛慢性心衰模型組12只。用4%水合氯醛按照大鼠體質量0.8 mL/100 g腹腔麻醉后，仰位固定，心電圖機以標準Ⅱ導聯監測動物心電圖。氣管插管，行人工呼吸（呼吸頻率70次/min，潮氣量7 mL，呼吸比設為1∶2）。于大鼠左前胸去毛，消毒，沿左鎖骨中線縱行切開皮膚1～2 cm，在第4或5肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，暴露心肌，用棉簽撥起左心耳，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間以左冠狀靜脈主干為標志，用圓形無創縫合針6/0絲線置于左冠狀動脈前降支起始部下2 mm處結扎，進針深度約為1.5 mm，寬度約為2～3 mm。記錄標準Ⅱ導聯心電圖，以ST段弓背向上抬高0.1 mv作為結扎成功的標志（無ST段及T波改變者淘汰）。假手術組穿線不結扎，清除胸腔內積血并用去針頭注射器抽吸氣體后逐層縫合、關閉胸腔縫合胸壁，待動物蘇醒后拔除氣管插管恢復自主呼吸。青霉素40萬單位加0.9%氯化鈉注射液0.9 mL（共1 mL）腹腔注射，連續3 d，預防感染。結扎成功后大鼠正常喂養4周后，于術后第5周開始模型組大鼠以按體質量0.5 mL/100 g灌胃20 mg/mL的左旋硝基精氨酸（L-NNA）4周。假手術組大鼠灌胃同等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.5 檢測指標及方法 1）各實驗組大鼠死亡情況及外觀表現。實驗過程中及時記錄各實驗組造模過程中死亡情況，外觀體征（諸如神疲、乏力、四肢欠溫、畏寒肢冷等一系列虛寒的外在表現）、精神狀況（諸如行為、運動、呼吸等表現）、飲食、排泄及水腫等癥狀等狀況。2）心陽虛慢性心衰大鼠呼吸代謝轉換率及產熱率［2］。冠狀動脈結扎手術后，隨機選取假手術組、模型組大鼠各6只分別于冠脈結扎初始的第1日、以后每隔2周進行呼吸代謝的檢測。首先應對TSE-System參照籠進行標準氣體的校正，冠脈結扎后大鼠放在TSE-System呼吸代謝系統的檢測籠內，每個檢測籠每次放1只，每次測試前及測試后應打開門窗以保證室內空氣的新鮮，相對濕度應控制在70%以內，室溫控制在20～25℃，測試前需先準確記錄大鼠體質量，流速持續控制在1.20 L/min，根據測試籠內氣體交換達到平衡穩定的時間設定數據每10 min采集1次，每組連續監測20 h，設定好參數后即可進行檢測。每次需測試的大鼠均應提前30 min放入代謝籠中，以讓大鼠充分適應檢測環境并達到檢測系統最佳循環及平衡狀態。測定兩組的呼吸轉換率 （RER）（RER=VCO2/VO2，其中VCO2、VO2分別是指單位時間內以參比籠作參照，測試籠產生的二氧化碳的量及消耗氧氣的量）以及產生的熱量H1［kcal/（h·kg）］和H2［kcal/（h·kg）］，H1、H2根據LBM方程H=（CVO2×VO2+CVCO2×VCO2）/1000計算［3］。H1是根據動物的實際體質量進行計算；H2是根據動物的瘦體質量 （即按動物脂肪占體質量比例除去動物脂肪以外的體質量）進行計算，兩者均是反映機體產熱量的指標。3）MPVS UltraTM壓力-容積系統檢測各組大鼠血流動力學指標。將壓力容積導管浸泡在37℃0.9%氯化鈉注射液中30 min，MPVS UltraTM壓力-容積測定儀與Millar壓力容積導管SPR-838正確連接后，對壓力、容積信號進行定標和信號的轉換。大鼠麻醉后背位固定，切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉，玻璃探針分離右側頸動脈，在動脈上穿線兩條，一條結扎遠心端，動脈夾夾住近心端，1 mL注射器針頭針尖處彎成鉤狀，在動脈壁上穿洞并勾起動脈壁，以輔助壓力容積導管沿頸總動脈逆行插入左心室，當導管的尖端（電極部分）完全插入頸動脈時，應快速結扎開口下端，避免大鼠失血過多影響監測結果，插管過程中隨時關注P-V Loop環，當出現規則的P-V Loop環時，表明導管已進入左心室，固定插管，對心臟功能進行檢測。血流動力學指標：左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左室等容收縮期壓力上升最速率（+dp/dtmax）及反映左室舒張功能的指標：左心室舒張所用時間（Tau）、左室舒張期壓力下降最大速率（-dp/dtmax）。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用Fisher確切概率法進行組間差異分析，t檢驗用于兩組間差異分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠死亡率比較 假手術組自實驗初始至結束均無死亡，模型組死亡6只，死亡率為50.00%，兩組差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 大鼠外觀表現 假手術組大鼠眼睛紅潤、呼吸均勻、毛發較光澤順貼多；精神正常、活潑好動；體溫穩定、體質量逐漸增加；飲食、排泄正常；抓取時反抗劇烈。模型組大鼠面部、耳部及四肢浮腫、唇舌紫暗；眼周及鼻腔充血；心悸氣短、呼吸短促、氣喘痰鳴；毛發疏松倒豎，無光澤，枯黃或微紅精神萎靡；眼瞇不欲睜開、縮肩拱背、喜扎堆蜷縮；行動遲緩肢冷、體寒尾涼；體質量減輕飲食、進水量減少；部分出現大便稀溏；抓取時反抗較輕。

2.3 兩組大鼠RER及產熱量（H1、H2）的動態比較見表1～表3，圖1～圖3。假手術組RER隨著時間延長表現出逐漸增強趨勢，H1、H2除第6周時略有減弱外，其趨勢同RER值表現一致。與假手術組比較，模型組在第2周時RER、H1、H2較冠脈結扎初始增強明顯，隨著時間的增長RER值第8周顯著性降低，H1、H2值第6周開始直到第8周都顯著降低（P＜0.01）。

圖1 心陽虛慢性心衰大鼠RER值隨時間變化

表1 兩組RER值隨時間變化的對比分析（±s）

表1 兩組RER值隨時間變化的對比分析（±s）

與模型組比較，**P＜0.01。

組別n 第4周 第6周 第8周假手術組 1 0 0 . 9 2 5 ± 0 . 0 2 4 0 . 9 4 2 ± 0 . 0 2 1 0 . 9 4 7 ± 0 . 0 2 7**模型組 1 2 0 . 8 7 1 ± 0 . 0 9 2 0 . 8 9 4 ± 0 . 0 2 7 0 . 7 3 5 ± 0 . 0 3 3第0周 第2周0 . 7 8 3 ± 0 . 1 0 7 0 . 8 4 7 ± 0 . 0 4 2 0 . 7 6 1 ± 0 . 0 8 7 0 . 8 9 3 ± 0 . 1 1 4

表2 兩組隨時間變化H1的對比分析［kcal/（h·kg），±s］

表2 兩組隨時間變化H1的對比分析［kcal/（h·kg），±s］

組別n 第4周 第6周 第8周假手術組 1 0 1 1 8 4 . 6 ± 1 9 2 . 7 1 0 2 7 . 9 ± 4 5 . 9**1 0 9 2 . 3 ± 2 1 8 . 6**模型組 1 2 9 7 9 . 6 ± 2 2 0 . 2 8 2 3 . 3 ± 6 3 . 9 6 8 1 . 8 ± 1 1 6 . 1第0周 第2周9 6 0 . 1 ± 1 7 1 . 6 1 0 8 9 . 5 ± 1 8 9 . 6 8 1 6 . 7 ± 1 0 0 . 6 1 3 7 3 . 6 ± 3 2 0 . 7

圖2 慢性心衰大鼠H1值隨時間變化

表3 兩組隨時間變化H2的對比分析［kcal/（h·kg），±s］

表3 兩組隨時間變化H2的對比分析［kcal/（h·kg），±s］

組別n 第4周 第6周 第8周假手術組 1 0 9 2 3 . 9 ± 1 4 7 . 5 8 2 6 . 2 ± 4 2 . 3**8 7 3 . 3 ± 1 9 5 . 6**模型組 1 2 7 6 8 . 1 ± 1 8 7 . 8 6 3 1 . 1 ± 6 0 . 9 5 1 1 . 2 ± 8 1 . 3第0周 第2周6 5 8 . 4 ± 1 2 9 . 7 7 6 6 . 4 ± 1 3 8 . 8 5 6 8 . 4 ± 8 6 . 8 1 0 0 0 . 1 ± 2 3 8 . 9

圖3 慢性心衰大鼠H2值隨時間變化

2.3 兩組心陽虛慢性心衰大鼠血流動力學檢測比較見表4。與假手術組比較，模型組大鼠心率（HR）、LVEDP、Tau呈上升趨勢，差異具有顯著性（P＜0.05）；左室內壓上升、下降最大速率均呈降低趨勢（P＜0.05）

表4 兩組慢性心衰大鼠心功能的影響比較（±s）

表4 兩組慢性心衰大鼠心功能的影響比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

+ d p / d t（m m H g / s）假手術組 1 0 8 9 . 8 ± 2 3 . 9 6 0 1 5 . 8 8 ± 1 8 9 3 . 3模型組 1 2 7 6 . 2 ± 1 8 . 9 2 8 9 5 . 8 3 ± 8 5 0 . 6 5**組別n L V S P（m m H g）L V E D P（m m H g）3 3 6 . 8 ± 3 1 . 7 -0 . 1 ± 3 . 7 3 9 7 . 3 ± 3 4 . 0*8 . 3 ± 4 . 8**H R（m i n-1）T a u（m s）5 7 5 3 . 5 ± 1 4 4 9 . 7 8 1 0 . 0 4 ± 2 . 4 9 3 0 1 1 . 8 ± 9 9 3 . 6 7**1 9 . 2 2 ± 4 . 4 8**-d p / d t（m m H g / s）

3 討 論

近年來中醫病證結合動物模型的研究進展顯示，目前就慢性心衰（心陽虛證）動物的造模文獻數量及規范化程度的整體水平偏低，歸納總結主要的制備方法有腹主動脈結扎結合寒冷刺激、冠脈結扎結合一氧化氮合酶抑制劑、及腹腔注射阿霉素［4-6］，研究表明這些方法基本符合中醫學陽虛心衰的病證，但是存在動物造模周期長、模型損傷比較大、模型出現時間節點不好判斷等問題。本實驗心陽虛證的制備是在左冠狀動脈前降支結扎制備心力衰竭心氣虛模型的基礎上，給予模型大鼠一氧化氮合酶抑制劑（LNNA），使大鼠血壓升高，心臟后負荷增加，心功能惡化致心衰的進一步發展，心氣虛證加劇，在癥狀、體征逐漸表現出心陽虛特點，采用這種方法制備的心陽虛慢性心衰模型，將更加符合臨床病證特點。

研究表明［7-8］，輕度缺血時，心肌的能量并沒有明顯變化或稍有增強，這是因為心衰早期，心臟會有一種有效的代償性反應，可增加心臟的收縮力，使心臟得以維持正常的血液循環，但在心衰后期，這種代償性反應將構成心肌肥厚，肥厚的心肌使心肌耗氧增加，而動脈供血不足使肥大的心肌出現心肌缺血、缺氧，最終構成心肌細胞凋亡，心肌組織纖維化。本實驗通過TSE呼吸代謝系統按照一定的時間間隔即從冠脈結扎初期，經過心衰早期發展至心衰后期，檢測假手術組與模型組大鼠22 h內呼吸代謝轉化率RER及能量代謝的動態變化H1、H2，通過對比假手術與模型組大鼠在相同時間間期下，其呼吸代謝及產熱量的對比分析，實時監測心陽虛慢性心衰的發展，其結果顯示，假手術組隨著時間的延長，體質量呈現均勻增長趨勢，其呼吸代謝轉化率及產熱量呈平穩增長趨勢。模型組大鼠在冠脈結扎2周時，RER值、H1、H2均較假手術組高，隨著時間延長至第4周，模型組大鼠RER值、H1值、H2值呈平穩下降趨勢。結合造模過程中動物外觀表現、死亡率等指標，可以較好的判斷研究的干預點。

實驗后期通過壓力容積檢測系統評價各組大鼠心功能。心衰的早期主要是心臟負荷的過重，心臟為滿足機體的需要表現為心室或心房代償性的擴張或心室壁的肥厚，隨著病情的加重導致心室重塑，出現心臟病理結構的改變及心臟功能的下降。由于心臟收縮之前回心血量的增加，使心臟在收縮時需要較大的張力，當心肌纖維拉長到一定范圍時，心臟的收縮力下降。±dp/dtmax和LVSP均是反映左心室心肌的收縮能力的指標，因此心衰發生時，會出現±dp/dtmax、LVSP的下降，此時，心臟為滿足機體需要主要通過增加心臟舒張末期左心室容量代償完成，導致左心室舒張末期壓力的增大，LVEDP、Tau是反映左心室舒張功能的指標，因此心衰時會出現LVEDP的升高，Tau時間的延長。本研究數據結果顯示與假手術組比較心陽虛慢性心衰模型組大鼠HR、LVEDP及Tau顯著性升高；±dp/dtmax及LVSP下降符合心陽虛慢性心衰心功能變化特點。

本研究通過前期結扎冠狀動脈左前降支，后期給予一氧化氮合酶抑制劑（左旋硝基精氨酸），采用無創的呼吸代謝系統動態監測大鼠的呼吸代謝、能量代謝變化情況來判斷模型狀態，建立大鼠心陽虛慢性心衰模型并通過全面檢測大鼠的呼吸代謝能量代謝及血流動力學等指標從宏觀上對各組大鼠機體表現進行綜合評價做為心陽虛慢性心衰模型的重要評價標準，彌補了傳統心衰模型建立實驗當中，對模型成功及造模周期難以把握的不足，為更客觀有效地評價動物模型提供了一種新的手段和方法。

（作者聲明：侯衍豹與尹翠翠并列第一作者）

［1］ 陳新宇，蔡虎志，余洪，等.慢性心衰心陽虛型病證動物模型的研究進展與評析［J］．中醫藥導報，2011，11（8）：108-109.

［2］ 李靜，楊勇，尹翠翠，等.腎陽虛小鼠模型呼吸代謝轉化率、產熱量指標的實驗研究［J］．山東中醫藥大學學報，2013，37（2）：148-150.

［3］ Vrang N，Madsen AN，Tang-Christensen M，et al.PYY（3-36）reduces food intake and body weight and improves insulin sensitivity in rodent models of diet-induced obesity［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，291（2）：R367-375.

［4］ 王大偉，楊喆，嚴夏．溫陽救心方對陽虛型慢性心衰大鼠心功能的影響［J］．中藥新藥與臨床藥理，2011，22（4）：410-413.

［5］ 王碩仁，趙明鏡，王振濤，等．建立心肌梗死心氣虛血瘀證和心陽虛血瘀證病證動物模型的研究［J］．中國中西醫結合雜志，2008，28（3）：245-248.

［6］ 張友計，雷蕾，李華，等．心力衰竭心陽虛證大鼠與心鈉素的相關性研究［J］．瀘州醫學院學報，2008，31（5）：508-511.

［7］ Catalucci，D.M.V.Latronico，O.Ellingsen，et al.Physiological myocardial hypertrophy：how and why［J］.Front Biosci，2008，13（6）：312-24.

［8］ 吳俊標．環維黃楊星D對心肌肥厚的影響及其作用機制［D］．廣州：廣州中醫藥大學，2012.

The Dynamic Monitoring on the Establishment and Evaluation of Rat Model of Chronic Heart Failure with Heart Yang Deficiency Based on Respiratory Metabolism System

HOU Yanbao，YIN Cuicui，YANG Yong，et al.Shandong University of TCM，Shandong，Jinan 250355，China

Objective：To establish and evaluate rat model of chronic heart failure with heart yang deficiency，according to the clinical manifestations of chronic heart failure，with the early ligation of the left anterior descending coronary artery，and the latter nitric oxide synthase inhibitor（L-NNA）.Methods：Wistar rats were randomly divided into two groups：the sham group and the model group of chronic heart failure with heart yang deficiency. Chronic heart failure was caused by coronary artery ligation in model group，the sham group threading without ligation.LNNA was given for 4 weeks to cause heart failure.Respiratory metabolism system was used to monitor the changes of respiratory metabolism and energy metabolism in rats during the experiment.The hemodynamics was used to evaluate the cardiac function of rats in each experimental group.At the end of the experiment，these data were recorded-Timely records of the deaths，the appearance of signs，Mental status（such as behavior，movement，breathing）diet，excretion and edema etc.Results：Different from the sham group，in the second week，respiratory metabolism and energy metabolism were significantly enhanced，compared with the initial coronary artery ligation，while in the Sixth to eighth week，the respiratory metabolism and energy metabolism of time showed a gradual weakening trend（P＜0.01）.Conclusion：Early ligation of the left anterior descending coronary artery，and the later nitric oxide synthase inhibitor（L-NNA）to establish and evaluate rat model of chronic heart failure with heart yang deficiency，with respiratory metabolism system can dynamically monitor the status and physiological function of animal，and accurately determine the time window of the model，providing an objective，noninvasive method to judge the rat model of chronic heart failure with heart yang deficiency.

Heart yang deficiency；Chronic heart failure；Respiratory metabolism；Energy metabolism；Hemo

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1335-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.008

2015-04-07）

山東省高等學校科技計劃項目（Z09LF31）

△通信作者（電子郵箱：yy7204＠163.com）