金黃色葡萄球菌β-內酰胺酶檢測方法的應用比較

劉敬王斌沈繼錄00中科院合肥物質研究院腫瘤醫院檢驗科0000中國科技集團公司第8研究所衛生院0000安徽醫科大學

金黃色葡萄球菌β-內酰胺酶檢測方法的應用比較

劉敬1王斌2沈繼錄3
230031中科院合肥物質研究院腫瘤醫院檢驗科1
230000中國科技集團公司第38研究所衛生院2
230000安徽醫科大學3

目的：比較頭孢硝噻吩液體（Cefinase）、頭孢硝噻吩紙片（Dryslide）、三葉草實驗（Cloverleaf）、青霉素邊緣實驗（Penicillin disk zone edge）檢測金黃色葡萄球菌β-內酰胺酶的敏感性和特異性。方法：分別用Cefinase，Dryslide，Cloverleaf，Penicillin disk zone edge檢測金黃色葡萄球菌β-內酰胺酶。結果：4種方法敏感度分別為83％、66％、91％、91％。特異度分別為100％、97％、100％、100％。結論：4種方法在檢測應用上都能為臨床提供可靠的結果，但Cloverleaf和Penicillin disk zone edge檢測β-內酰胺酶的試驗較敏感，在操作上用頭孢硝噻吩紙片法更能被實驗室所接受。關鍵詞 β-內酰胺酶；金黃色葡萄球菌；頭孢硝噻吩液體；青霉素紙片

β-內酰胺酶類抗生素因其抗菌活性高、毒性低的優點屬現今臨床各種感染最常用的藥物[1]。隨著β-內酰胺類抗生素的廣泛應用甚至濫用以及致病菌的變遷，使得產生β-內酰胺酶的病原菌越來越多，是目前造成細菌高度耐藥的重要原因之一[2]。現對本院2013年1-12月臨床分離的12株對青霉素敏感的金黃色葡萄球菌和30株對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌用Cefinase液體法（A）、Dryslide干粉法（B）、Cloverleaf法（C）和Penicillin disk zone edge（D）同時進行β-內酰胺酶檢測，比較4種方法檢測結果的敏感性和特異性。

資料與方法

材料：①菌株來源：臨床分離的對青霉素敏感的金黃色葡萄球菌12株和臨床分離的對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌30株，均來自本院2013年1-12月住院及門診患者送檢的標本。質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213為產酶陽性對照菌，金黃色葡萄球菌ATCC 25923為產酶陰性對照菌。②儀器：使用德國西門子細菌分析儀做細菌鑒定和藥敏實驗，青霉素紙片（10U）、試劑購自英國OXOID公司，頭孢硝噻吩紙片購自梅里埃診斷產品（上海）有限公司，頭孢硝噻吩液體購自美國BD公司。

方法：①Cefinase液體法：Cefinase用梅里埃診斷產品，讓試劑放置于室溫條件中，用無菌去礦物水浸濕紙片，沾取少量待測菌菌落到紙片表面，出現紅色為陽性，1 h后無顏色改變為陰性。②Dryslide干粉法：Dryslide法用美國BD公司的頭孢硝噻吩干粉，以Nitrocefin Rehydration 2mL稀釋液將Nitrocefin 1mg稀釋，將頭孢硝噻吩液體滴在待測菌上，顏色由黃色變為紅色為陽性，不變色為陰性。③Cloverleaf法：Cloverleaf用金葡菌標準菌株涂布，待測菌劃線，十字交界處帖青霉素紙片，培養24 h觀察結果。④Penicillin disk zone edge：青霉素邊緣試驗用待測菌配成0.5濁度涂布，然后做青霉素紙片藥敏試驗，培養24 h觀察結果，抑菌圈＞19mm為陽性。

統計學方法：采用χ2檢驗分別做4種方法檢出結果的差異檢驗和關聯性檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結果

對青霉素敏感的金葡菌12株，對青霉素耐藥的金葡菌30株。結果見表1、表2。

討論

本文通過用4種方法同時對青霉素敏感的金黃色葡萄球菌12株和臨床分離的青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌30株進行檢測，其檢測結果差異無統計學意義（χ2=0.50，P＞0.05），充分說明四種方法就本實驗室的β-內酰胺酶檢測應用中的可行價值。

2013CLSI以前曾經推薦：假如青霉素的抑菌圈≥29mm或最小抑菌濃度≤0.12μg/mL時，在報告“S”時應采用頭孢硝噻吩測定β-內酰胺酶。繼續劃線分離后續菌株，可以考慮采用PCR測定BlaZ基因[3]。

當有β-內酰胺酶存在時，頭孢硝噻吩的β-內酰胺環能被β-內酰胺酶破壞，使其顏色由黃色變為紅色，在操作方法上，頭孢硝噻吩紙片法是目前單底物中最敏感的，且廣譜，簡便易行，特異性高達100％，但其在某些條件下仍出現假陽性、假陰性，敏感性較低。頭孢硝噻吩液體法雖然較頭孢硝噻吩紙片法敏感度有所提高，但較紙片法操作復雜，在臨床不建議使用，適合科研，易保存[4]。Cloverleaf法敏感度91％，特異度100％，Cloverleaf法最大的優勢在于將ATCC25923（β-內酰胺酶誘導陰性的指示菌）質控和待測菌同時涂抹于5％羊血平板上，待測菌劃線，貼10 U青霉素紙片，培養24 h，觀察結果。結果較明顯。

尋求一種特異度好、敏感度高的檢測方法，正是檢驗工作者的共同目標，因為只有保證質量，才能為臨床提供有價值的報告，也才能更好地為患者服務。常用的β-內酰胺酶檢測方法除以上4種外，還有微生物活性消失法、酸測量法、碘量法等[5]，但目前最常用的方法還是青霉素邊緣實驗法，因其操作簡便，如無法開展淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、莫拉菌等藥敏試驗的實驗室，用此法替代就能給臨床診治帶來方便。因此，在對β-內酰胺酶檢測方法的選擇上，青霉素邊緣實驗法更能被廣大實驗室所接受，而做好β-內酰胺酶檢測工作更顯得極為重要。葡萄球菌的多重耐藥性除與產生β-內酰胺酶有關外，與抗生素的不合理使用也密切相關。因此，選擇一種特異度好、敏感度高的細菌鑒定藥敏方法，作為臨床醫生合理選藥的參考指標，為臨床合理使用抗生素提供了有力的保障。

表1 4種方法檢測β-內酰胺酶結果

表2 4種方法檢測β-內酰胺酶敏感度和特異度（％）

[1] 陳艷清,賈建.頭孢硝噻吩紙片法檢測P-內酰胺酶的評價[J].中華醫院感染學雜志, 2004,14（2）：25-27.

[2] 唐群力.兩種β-內酰胺酶檢測方法的應用比較[J].檢驗醫學與臨床,2008,5（7）：427-428.

[3] 熊自忠.β-內酰胺酶的研究新近展[J],中國抗感染化療雜志,2001,1（1）：61-62.

[4] 馬文杰,吳鏑,劉芳,等.醫院感染產β-內酰胺酶金黃色葡萄球菌耐藥性研究分析[J].中華醫院感染學雜志,2014,（20）：4958-4960.

[5] 袁紅萍,周文俊,朱奮勇,等.臨床常見病原菌的分布及耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志,2014,（8）：1854-1856.

Com parison of the app lication o f detection m ethods on Staphylococcus aureusβ-lactam ase

Liu Jing1,Wang Bin2,Shen Jilu3
DepartmentofLaboratory,CancerHospitalofHefei Institute ofMaterial,Chinese Academy ofSciences2300311
The No.38Research Institute ofHealth,China Technology Group Corporation 2300002
AnhuiMedicalUniversity2300003

Objective：To compare the sensitivity and specificity of nitrocefin liquid（Cefinase）,nitrocefin paper（Dryslide）,clover experiment（Cloverleaf）,penicillin edge experiments（Penicillin disk zone edge）in the detection of Staphylococcus aureus β-lactamase.Methods：We detected Staphylococcus aureusβ-lactamase by Cefinase,Dryslide,Cloverleaf,Penicillin disk zone edge respectively.Results：The sensitivity of the 4methodswas 83％,66％,91％,91％.The specificitywas 100％,97％,100％,100％.Conclusion：The 4methods can provide reliable results for the clinicalapplication,but the Cloverleafand disk zoneedge Penicillin testing are sensitive to the test of theβ-lactamase.Themethod of the Nitrocefin paper can bemore accepted by the laboratory from the operation.

β-lactamase；Staphylococcusaureus；Nitrocefin liquid；Penicillin paper

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.27.76