響應面法優化超臨界CO2萃取鮑魚內臟油脂及其脂肪酸種類測定

湯 鵬，段海霞，夏金梅*，翁武銀，李 倩，許建中，林 翌，許 晨

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；3.國家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005）

響應面法優化超臨界CO2萃取鮑魚內臟油脂及其脂肪酸種類測定

湯 鵬1，段海霞2，夏金梅3,*，翁武銀1，李 倩3，許建中3，林 翌3，許 晨3

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；3.國家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005）

以鮑魚內臟為原料，采用超臨界CO2流體萃取油脂。根據萃取溫度、萃取壓力、靜態萃取時間對油脂萃取率影響的結果，運用SAS 9.2統計學軟件進行響應面試驗設計，優化萃取條件。結果表明，超臨界CO2萃取鮑魚內臟油脂的最佳條件為：萃取壓力31.2 MPa、萃取溫度42.3 ℃、靜態萃取時間9.4 min。在該條件下的實際萃取率為75.23%。將獲得的油脂，利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜檢測，結果發現，萃取鮑魚內臟油脂中共有39 種不同碳鏈長度和雙鍵數目的脂肪酸，其中飽和脂肪酸9 種、單不飽和脂肪酸8 種、多不飽和脂肪酸22 種。

超臨界CO2；響應面；鮑魚內臟；質譜

鮑魚是一種海洋單殼軟體貝類，屬軟體動物門、腹足綱、原始腹足目、鮑科[1]。研究表明，鮑魚內臟中含有大量的蛋白質、脂質和碳水化合物，其中占鮑魚內臟濕基質量4%左右的脂質[2]，含有豐富的不飽和脂肪酸和磷脂[3-5]，有較高的食用和藥用價值[6-7]。目前，我國鮑魚加工中，絕大部分鮑魚內臟僅作為飼料使用，附加值低。我國鮑魚養殖規模世界第一，并且增長迅速。2010年，我國鮑魚總產量占世界總產量的86%，達到5.65萬 t[8]，2012年已突破9萬 t，鮑魚內臟油脂提取將形成一宗很好的自然油脂資源。

從水產品及其副產物中提取油脂的傳統方法包括有機溶劑浸提法[9]、壓榨法[10]、蒸煮法[11]、稀堿法[12-13]和酶解法[14]等。這些方法有的涉及有機溶劑，有的涉及高溫或較長的提取時間，會造成溶劑殘留或不飽和脂肪酸氧化，從而降低油脂的品質。隨著人們對食品安全問題的日益關注以及對天然油脂的需求增加，傳統提取技術的不足促使人們尋求新的替代技術。超臨界CO2萃取技術不僅能提供溫和、無氧的操作條件，降低萃取過程中不飽和脂肪酸的氧化，而且還能選擇性地萃取極性較低的脂質物質，萃取物純度較高。CO2無味、無臭、無毒、不燃，萃取后通過壓力釋放可以非常方便地實現溶劑與脂質的分離，免除溶劑的蒸餾分離問題，后處理簡單。在過去幾年里，采用超臨界CO2流體從水產品加工副產物中提取高品質油脂引起了許多研究者的興趣[15-18]。但采用超臨界CO2流體萃取鮑魚內臟油脂，國內外罕見報道。本實驗研究超臨界CO2流體提取鮑魚內臟油脂的工藝條件，分析檢測萃取油脂的組分，為鮑魚油脂的分析檢測、提取利用建立技術依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

鮑魚內臟島之原生物科技有限公司；CO2氣體（純度＞99.5%）林德氣體有限公司。

1.2儀器與設備

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀美國Waters公司；Spe-ed SFE-2型超臨界CO2萃取儀美國Applied Separations公司；UV-9100紫外分光光度計北京瑞利分析儀器公司；XFB-800中藥粉碎機吉首市中州制藥機械廠；離心濃縮儀北京勤誠盛達科學儀器有限公司；JA4103型精密電子天平蘇州江東精密儀器有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；DZF-6050型真空干燥箱上海一恒科技有限公司；B-811型通用萃取系統瑞士Büchi公司；QP-2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀日本島津公司。

1.3方法

1.3.1鮑魚內臟粉水分含量的測定

按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》規定的方法，精確稱取5.000 0 g鮑魚內臟粉于烘干至恒質量的稱量瓶中，置105℃中干燥4 h后，取出放入干燥器內冷卻0.5 h，稱質量后再放入105℃烘箱中烘干2 h，取出，放入干燥器內冷卻0.5 h后再稱質量。重復上述操作至前后2次質量差不超過2 mg，即為恒質量。按公式（1）計算水分含量。

式中：X0為鮑魚內臟粉水分含量/%；m0為稱量瓶和鮑魚內臟粉烘干后質量/g；m1為稱量瓶和鮑魚內臟粉質量/g；m2為稱量瓶質量/g。

1.3.2鮑魚內臟粉總脂肪提取

精確稱取鮑魚內臟粉5.00 g，置于索式提取器提取室中，石油醚回流提取6 h，收集萃取相，揮干石油醚后用離心濃縮儀除去水分，稱質量。按公式（2）計算總脂肪含量。

式中：X1為鮑魚內臟粉總脂肪含量/%；m3為接收瓶質量/g；m4為接收瓶和萃取脂肪質量/g；m5為鮑魚內臟粉質量/g。

1.3.3超臨界CO2萃取鮑魚內臟油脂

取10.00 g鮑魚內臟粉放入50 mL萃取釜中，調節萃取壓力、萃取溫度到設定值，靜態萃取一定時間后，打開降壓閥，油脂沉降在收集管中，排出CO2。減壓過程中CO2的流速為1.5 L/min，分離溫度70℃。將收集到的油脂用離心濃縮儀除去水分后稱質量。按公式（3）計算萃取率。

式中：X2為超臨界CO2萃取鮑魚內臟油脂萃取率/%；m6為接收管質量/g；m7為接收管和萃取脂肪質量/g；m8為鮑魚內臟粉質量/g。

1.3.4 超臨界CO2萃取條件的優化

采用單因素試驗考察原料含水量、萃取壓力、萃取溫度、靜態萃取時間對萃取率的影響，單因素試驗的因素與水平見表1。在單因素試驗基礎上，用SAS 9.2統計學軟件，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇萃取壓力（X1）、萃取溫度（X2）和靜態萃取時間（X3）主要影響因素為自變量，以萃取率為響應值，采用響應面分析法，對鮑魚內臟油脂超臨界CO2萃取條件參數進行優化。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表2。

表1 單因素試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in one-factor-a-time design

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平編碼表Table 2 Factors and their coded levels used inBox-Behnken experimental design

1.3.5鮑魚內臟油脂的皂化和甲酯化

取上述萃取得到的油脂樣品，加入1 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，70℃回流加熱2 h。反應結束后，加入正己烷萃取不皂化物，棄去正己烷層。收集下層溶液并向其中依次加入2 mol/L鹽酸溶液、大量水和一定量正己烷，分離得到正己烷層并旋干，即得到脂肪酸。脂肪酸中加入一定量1%硫酸-甲醇溶液，60℃回流5 h后，加入大量水和一定正己烷，將分離得到的正己烷層用水洗至中性，加入無水硫酸鈉，分離正己烷溶液并旋干，即得到脂肪酸甲酯[19]。準確稱取所得脂肪酸樣品0.020 00 g，用乙腈溶液定容至20 mL，即得用于液相色譜-質譜分析的1 mg/mL樣品乙腈溶液。準確稱取所得脂肪酸甲酯樣品0.020 00 g，用正己烷溶液定容至20 mL，即得用于氣相色譜-質譜分析的1 mg/mL樣品正己烷溶液。

1.3.6 脂肪酸的分析

1.3.6.1 液相色譜及質譜條件

色譜條件：XBrideg BEH C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，2.5 μm）；流動相：A為超純水，B為色譜級乙腈；流動相梯度：0～10 min，流動相B為75%，10～25 min，流動相B由75%升到100%；流速0.3 mL/min；進樣量1 μL。

一級質譜條件：電噴霧離子源，負離子模式；數據采集范圍m/z 50～1 200；毛細管電3 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流速600 L/min；鎖定質荷比物質：亮氨酸腦啡肽，其在負離子模式下的精確質荷比為554.261 5。

1.3.6.2 氣相色譜及質譜條件

色譜條件：R x i?-5 M S彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度170 ℃，以2 ℃/min升至250 ℃，再以250 ℃保持20 min；進樣量1 μL；載氣（He）流量1 mL/min；吹掃氣流量3 mL/min；分流比為1∶10。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度250℃；電子倍增器電壓1 000 V；接口溫度250℃；質量掃描范圍m/z 40～500；溶劑切除時間3.52 min。

1.4數據處理

液相色譜使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜系統采集得到譜圖數據，通過MassLynx 4.1軟件進行分析。

氣相色譜-質譜通過Postrun Analysis化學工作站數據處理系統，檢索NIST 27和NIST 147譜圖庫，確定樣品中各個化學成分。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1原料含水量對萃取率的影響

圖1 原料含水量對萃取率的影響Fig.1 Effect of raw material moisture content on extraction rates

在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45℃、靜態萃取時間15 min條件下，考察原料含水量對萃取率的影響。通過1.3.1節方法測得在自然條件下晾干的鮑魚內臟粉含水量為10.48%，通過回吸法和真空干燥法得到其他不同含水量的樣品。原料含水量對萃取率的影響如圖1所示，隨著含水量的增大，萃取率先增大后減少，當含水量為10.48%時萃取率達到最大。含水量對萃取率的影響體現在兩個方面：適當的含水量有利于超臨界CO2的擴散、傳質和油脂在超臨界CO2中的溶解；水分含量低時，這種促進作用較小，油脂的提取率降低；水分含量高時，傳質阻力增大，不利于CO2的滲入和油脂的溶出。所以樣品選擇自然晾干處理。

2.1.2萃取壓力對萃取率的影響

圖2 萃取壓力對萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on extraction rates

選取含水量為10.48%的樣品，在萃取溫度45 ℃條件下靜態萃取15 min，考察萃取壓力對萃取率的影響，結果見圖2。由于設備所能承受的最大壓力為35 MPa，所以試驗時的最大壓力設置為33.5 MPa。從圖2可以看出，萃取率隨萃取壓力的增加而增大，當壓力超過25 MPa后，萃取率增大速率相對變緩。這是由于當萃取溫度一定時，隨著萃取壓力的升高，超臨界CO2的密度增大，其對溶質的溶解能力增加[20]。但萃取壓力持續增大，超臨界CO2的不可壓縮性將逐漸增強，其密度變化率將減小，溶解度的增幅將降低。此外，高壓會增加設備的投入和操作費用，且存在安全隱患。所以從經濟和安全的角度考慮，萃取壓力選擇30 MPa。

2.1.3萃取溫度對萃取率的影響

圖3 萃取溫度對萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rates

選取含水量為10.48%的樣品，在萃取壓力30 MPa條件下靜態萃取15 min，考察萃取溫度對萃取率的影響，結果見圖3。萃取率隨著萃取溫度的升高呈先增后減的趨勢，40 ℃時萃取率達到最大。萃取壓力一定時，萃取溫度對溶質在超臨界CO2流體中的溶解度有兩個方面的影響：當萃取溫度升高時，溶質的蒸汽壓增大，提高了傳質動力，有利于萃取率的提高；另一方面，隨著萃取溫度的升高，超臨界CO2流體的密度降低、溶劑化效應下降，使溶質的溶解度下降，萃取率降低[21]。因此，萃取溫度對萃取率的影響取決于上述兩個方面的競爭關系。試驗選擇40 ℃為最適溫度。

2.1.4靜態萃取時間對萃取率的影響

圖4 靜態萃取時間對萃取率的影響Fig.4 Effect of static extraction time on extraction rates

選取含水量為10.48%的樣品，在萃取壓力30 MPa、萃取溫度40 ℃條件下，考察靜態萃取時間對萃取率的影響，結果見圖4。萃取率隨著靜態萃取時間的延長呈現先增加后減小的趨勢，在靜態萃取時間為10 min時萃取率達到最大。萃取初期，由于溶質和溶劑未達到良好接觸，萃取率較低；隨著靜態萃取時間的延長，體系逐漸達到最佳的傳質狀態，萃取率逐漸增加至最大值；隨后，由于萃取對象中待分離成分含量減少而使單位時間萃取量逐漸下降，靜態萃取時間對萃取率提高的影響逐漸減弱。靜態萃取時間大于10 min后，萃取率會略有下降，可能是由于已萃取出的油脂被CO2氣體從解吸缸中帶出所致。

2.2 Box-Behnken試驗設計方案與響應面分析

2.2.1 Box-Behnken試驗結果

根據單因素試驗結果，選擇萃取壓力（X1）、萃取溫度（X2）、靜態萃取時間（X3）為考察因素，以萃取率（Y）為響應值進行Box-Behnken試驗設計，15 個試驗點的試驗結果見表3。15 個試驗點分為2 類：1～12為析因點；13～15為區域的中心點，用以估計試驗誤差[22]。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental resuullttss

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗

用SAS 9.2統計學軟件對表3中的試驗結果進行回歸擬合分析，得鮑魚內臟油脂萃取率與各因素變量的多元二次回歸方程為：

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

2.2.3 響應因子水平的優化

由圖5可知，X1、X2和X3存在極值點，為進一步驗證最佳點的值，對回歸方程求一階偏導并整理得方程組（4）～（6）：

解方程組（4）～（6）得：X1=3 1.2 3 1 4、X2=42.268 1、X3=9.365 1。代入回歸方程，解得預測的萃取率為75.338 07%。考慮到實際操作性，將鮑魚內臟油脂的最佳萃取條件修正為：萃取壓力31.2 MPa、萃取溫度42.3 ℃、靜態萃取時間9.4 min。在此修正條件下的實際萃取率為75.23%，與預測值相差不大，證明模型有效。

圖5 各兩因素交互作用對鮑魚內臟油脂萃取率影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three extraction conditions on oil yield

2.3 脂肪酸分析

按上述優化的萃取方法獲得的鮑魚內臟油脂經皂化后，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜檢測，MassLynx 4.1軟件分析，得到總離子流圖（圖6）。總離子流圖上的每一個點都對應一張質譜圖。以保留時間3.332 min為例，將峰進行積分，得到質譜圖（圖6）。該保留時間處離子強度最大的質荷比為225.185 2和275.200 5。用MassLynx 4.1軟件可對由四極桿-飛行時間-高分辨質譜得到的質荷比對應的分子式進行預測。以質荷比為225.185 2為例，已知脂肪酸的元素組成為C、H、O，分析顯示，質荷比225.185 2對應的分子式只有一種可能，為C14H25O2，考慮到C14H25O2是其對應的脂肪酸減H形成的負離子，所以質荷比225.185 2對應的脂肪酸為C14H26O2。同理，質荷比275.200 5對應的脂肪酸為C18H28O2。精確質荷比得到的可能的分子式范圍大大縮小，從而在很大程度上提高了分子式預測的準確性，但僅憑分子式只能計算分子的不飽和度，若需要明確雙鍵的位置還需要其他手段。

圖6 鮑魚內臟油脂脂肪酸總離子流圖和質譜圖Fig.6 Total ion current chromatogram and mass spectrum of fatty acids from abalone visceral oil

表5 鮑魚內臟油脂脂肪酸的組成Table 5 Fatty acid composition from abalone visceral oil

利用四極桿-飛行時間-質譜高分辨得到的質荷比數據，對相應的質荷比對應的分子式進行預測，結果見表5。由表5可知，依據碳鏈長度和雙鍵數目的不同，鮑魚內臟油脂含有脂肪酸39 種，碳鏈長度在C12～C24，雙鍵數目在0～7，其中飽和脂肪酸有9 種，單不飽和脂肪酸有8 種，多不飽和脂肪酸有22 種。本實驗通過精確質荷比預測脂肪酸的分子式，未確定雙鍵位置的具體信息，因此未能將脂肪酸的同分異構體進行區分。

氣相色譜-質譜得到可能的脂肪酸組成信息在表5的最后一列體現。將氣相色譜-質譜得到的質譜圖進行數據庫檢索，共檢測到21 種脂肪酸。其中多種脂肪酸存在同分異構體，如十六碳單烯酸有2 種，十八碳單烯酸有2 種。有25 種液相色譜-質譜法檢測到的脂肪酸未在氣相色譜-質譜系統檢測到，如十二碳烷酸和二十二碳三烯酸等。

本實驗使用液相色譜-質譜和氣相色譜-質譜2 種方法檢測鮑魚內臟中的脂肪酸，由表5可知，盡管不能得到脂肪酸同分異構體的信息，液相色譜-質譜仍能檢測到更多種類的脂肪酸。此外，氣相色譜-質譜法需要先將脂肪酸進行甲酯化處理，而液相色譜-質譜法可直接分析檢測脂肪酸。

無論是液相色譜-質譜法的精確質荷比進行分子式預測，還是氣相色譜-質譜法的數據庫檢索，所提供的都只是可能的脂肪酸結構信息，若需確定每種脂肪酸的確切結構，還需要二級質譜檢測[23]和標準品比對[24]等手段。

3 結 論

通過SAS 9.2統計學軟件的響應面分析，對超臨界CO2萃取鮑魚內臟油脂條件進行優化，得出最佳萃取條件為：萃取壓力31.2 MPa、萃取溫度42.3 ℃、靜態萃取時間9.4 min，鮑魚內臟油脂的萃取率可達75.23%。

超臨界CO2萃取獲得的鮑魚內臟油脂中共檢測出39 種脂肪酸，碳鏈長度在C12～C24，雙鍵數目在0～7，其中飽和脂肪酸9 種、單不飽和脂肪酸8 種、多不飽和脂肪酸22 種。

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Optimization of Supercritical CO2Extraction of Abalone Visceral Oil by Response Surface Methodology and Analysis of Fatty Acid Composition

TANG Peng1, DUAN Haixia2, XIA Jinmei3,*, WENG Wuyin1, LI Qian3, XU Jianzhong3, LIN Yi3, XU Chen3

(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 3. Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources, Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China)

Supercritical CO2was used to extract abalone visceral oil. To optimize the extraction conditions, the statistical software SAS 9.2 was applied to design the experiment with response surface methodology. The impacts of pressure, temperature, and time on extractability were investigated. It was found that the optimum extraction pressure, temperature and time were 31.2 MPa, 42.3 ℃ and 9.4 min, respectively. The extraction rate was 75.23% under the optimized conditions. Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was then used to analyze the extracted oil. A total of 39 fatty acids with different lengths of carbon chain and numbers of double bonds were detected, including 9 kinds of saturated fatty acids, 8 kinds of monounsaturated fatty acids and 22 kinds of polyunsaturated fatty acids.

supercritical CO2; response surface methodology; abalone viscera; mass spectrometry

TS225.6；TS224.4

A

1002-6630（2015）12-0153-07

10.7506/spkx1002-6630-201512029

2014-11-01

廈門市海洋經濟發展專項資金項目（13CZP003HJ05）；海洋公益性行業專項（201105029）；

國家重大科學儀器設備開發專項（2013YQ170525）

湯鵬（1987—），男，碩士研究生，主要從事鮑魚內臟多糖的分離純化研究。E-mail：tp.gaint@163.com

*通信作者：夏金梅（1981—），女，助理研究員，博士，主要從事海洋生物代謝組學研究。E-mail：xiajinmei@tio.org.cn