內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白Caspase-12在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型中的作用研究

黃 艷，李曉慧，吳正升，王 歡，汪應(yīng)紅，李海迪，孫仕偉，李 俊

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白Caspase-12在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型中的作用研究

黃 艷1，2，李曉慧1，2，吳正升3，王 歡1，2，汪應(yīng)紅1，2，李海迪1，孫仕偉1，李 俊1，2

目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）標(biāo)志性蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）在大鼠肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)恢復(fù)病程中的作用。方法建立四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，蘇木精－伊紅染色和Masson膠原纖維染色觀察肝臟病理組織學(xué)改變；免疫組化法檢測肝組織肝纖維化標(biāo)志性蛋白α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）以及鈣激活蛋白酶（Calpain）的表達(dá)；Western blot檢測不同時期肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)變化。結(jié)果肝臟病理組織學(xué)檢測提示肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型成功。免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽性細(xì)胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實質(zhì)肝細(xì)胞區(qū)域。逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期，α-SMA抗原表達(dá)陽性細(xì)胞與模型組比較逐漸下降。Calpain抗原表達(dá)陽性細(xì)胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位。Western blot結(jié)果顯示，模型組肝臟Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)與正常組相比顯著升高。與模型組相比，逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2、4和8周組肝組織Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)降低，但仍高于正常組。結(jié)論 ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在于大鼠肝纖維化病程中，可能與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)逆轉(zhuǎn)密切相關(guān)。

肝纖維化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡；Calpain；Caspase-12

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是繼死亡受體活化和線粒體損傷之后第3條介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ERS誘導(dǎo)的3條主要凋亡通路為CHOP／GADD153基因的激活通路、氨基末端蛋白激酶（c-jun NH2-terminal protein kinasec-jun，JNK）激活通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的Caspase-12激活通路。目前研究［1－2］表明多種肝臟疾病的發(fā)生與Caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。但Caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否存在于肝纖維化的進(jìn)展、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期中，其作用如何尚未有文獻(xiàn)報道。該實驗建立在四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型基礎(chǔ)上，觀察ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期中的變化及其可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只雄性SD大鼠，SPF級，180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑CCl4購自汕頭西隴化工廠；細(xì)胞組織裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF購自上海碧云天公司；毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、衣霉素（tunicamycin，TN）、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺購自美國Sigma公司；Cleaved-Caspase-3抗體購自美國Cell signaling公司；Cleaved-Caspase-12抗體購自美國Biovision公司；Calpain和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記抗兔和抗鼠免疫球蛋白（immunoglobin G，IgG）購自北京中杉金橋公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2周組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周組和逆轉(zhuǎn)恢復(fù)8周組，每組10只。除正常組外，每組大鼠按1 ml／kg皮下注射CCl4溶液（按體積比CCl4：花生油＝1∶1），一周2次，共12周。正常組以相同方法注射等量花生油作對照。模型組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2周組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)8周組分別于造模結(jié)束后第0、2、4、8周分批處死大鼠，取肝組織樣本迅速冷凍保存。

1.3.2病理學(xué)檢查 肝組織用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，做常規(guī)組織切片，蘇木精－伊紅（HE）染色和Masson膠原纖維染色，鏡下觀察并比較不同時期組織的病理變化。

1.3.3免疫組化檢測肝組織α-SMA和Calpain蛋白表達(dá) 大鼠肝組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。采用SP法染色，切片常規(guī)脫蠟，加50 μl過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育15 min；PBS沖洗后加0.1%的胰蛋白酶消化20 min，加50 μl非免疫性動物血清，室溫下孵育10 min；加50 μl的一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗后加50 μl生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min；再加50 μl鏈霉菌抗生素蛋白－過氧化物酶溶液，室溫下孵育30 min；DBA顯色、蘇木精復(fù)染、封片觀察。

1.3.4Western blot法檢測肝組織Calpain、Cleaved-Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá) 取經(jīng)處理后的肝組織，加500 μl RIPA細(xì)胞裂解液、5 μl PMSF于冰上裂解30 min后4℃、12 000 r／min離心30 min。取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上。用5%的脫脂牛奶封閉3 h后，與1∶500一抗4℃孵育過夜。再與1∶5 000的HRP標(biāo)記的IgG室溫孵育1 h，ECL顯色，Quantity One軟件測定分析結(jié)果。采用β-actin作為內(nèi)參照，分別以相應(yīng)蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白相對表達(dá)水平。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析檢驗。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理變化HE染色及Masson膠原纖維染色結(jié)果顯示正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列成肝索狀；模型組可見大量膠原纖維沉積于小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位形成纖維間隔及假小葉，并伴有大量脂肪空泡。停止注射CCl4，經(jīng)2、4、8周，可見大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)中脂肪空泡逐漸減少，纖維間隔逐漸變窄，纖維沉積程度逐漸減輕，提示CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化以及逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型成功。見圖1。

2.2 肝纖維化不同時期肝組織中α-SMA和Calpain蛋白表達(dá) 免疫組化法檢測α-SMA和Calpain蛋白在肝纖維化大鼠不同時期肝組織中的表達(dá)，陽性染色細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。結(jié)果顯示正常組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽性表達(dá)較少，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽性細(xì)胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實質(zhì)區(qū)域。逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2、4、8周組中，α-SMA、Calpain抗原表達(dá)陽性細(xì)胞與模型組比較，隨著逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期時間延長，陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量及程度逐漸下降，Calpain抗原表達(dá)陽性細(xì)胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位，與肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）大致位置相同。提示肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期表達(dá)α-SMA的活化的HSCs逐漸減少，肝細(xì)胞凋亡減少。見圖2。

2.3 Western blot法檢測不同時期肝組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)與正常組大鼠肝臟組織相比，模型組大鼠肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多；而與模型組相比，肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2、4、8周組中，Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞大量凋亡和靜止的HSCs活化增殖，合成大量膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積引起［3］。因此，抑制肝細(xì)胞壞死凋亡和促進(jìn)活化的HSCs凋亡，有助于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)恢復(fù)［4］。

研究［5－7］表明ERS在肝纖維化的進(jìn)展期抑制HSCs活化，在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期促進(jìn)活化的HSCs凋亡。研究［8］顯示HSCs與ERS誘導(dǎo)劑TG或TN體外共培養(yǎng)，CHOP、JNK和Caspase-12的表達(dá)明顯變化，其可能與逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期ERS誘導(dǎo)活化HSCs凋亡增加密切相關(guān)。

有研究［9－10］表明，當(dāng)ERS激活時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將儲存的Ca2＋釋放到細(xì)胞胞質(zhì)中與鈣離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而激活Calpain。細(xì)胞質(zhì)鈣活化蛋白導(dǎo)致的鈣外流的刺激，裂解并且激活Caspase-12，啟動下游的凋亡路徑Caspase-3，發(fā)生凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)［11－12］。本實驗建立CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型，采用HE染色、Masson膠原纖維染色驗證模型成功。免疫組化法檢測α-SMA和Calpain蛋白在大鼠肝組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，隨著恢復(fù)期時間延長，大鼠肝組織中α-SMA和Calpain陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量及程度逐漸下降提示HSCs活化降低；而Calpain抗原表達(dá)陽性細(xì)胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位，與HSCs細(xì)胞的大致位置相同，提示Ca2＋依賴性Calpain活化可能參與Caspase-12誘導(dǎo)的大鼠HSCs凋亡。Western blot法結(jié)果進(jìn)一步表明，模型組大鼠肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)較正常組明顯增多；而肝纖維化恢復(fù)期2、4、8周組中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合實驗室前期研究結(jié)果：模型組Cleaved-Caspase-12表達(dá)顯著上升，提示Caspase-12誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡參與肝纖維進(jìn)展期；在肝纖維化逆轉(zhuǎn)復(fù)期，Cleaved-Caspase-12在活化HSCs中表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)活化HSCs凋亡增加，但其整體表達(dá)水平逐漸下降，提示其誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡顯著降低。本實驗結(jié)果表明，ERS存在于大鼠肝纖維化病程中，其可能參與肝細(xì)胞和HSCs增殖活化、凋亡的調(diào)控，與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展和逆轉(zhuǎn)恢復(fù)密切相關(guān)。

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Effect of endoplasmic reticulum stress protein caspase-12 in carbon tetrachloride-induced reversible liver fibrosis in rats

Huang Yan1，2，Li Xiaohui1，2，Wu Zhengsheng3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，3Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo detect the effect of endoplasmic reticulum stress（ERS）-related protein Caspase-12 in rat liver fibrosis and spontaneous reversal process.MethodsLiver fibrosis model was induced by CCl4in rats，the protein expressions of Calpain and α-SMA were detected by immunohistochemical staining.The protein expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 in liver tissue were measured by Western blot.ResultsImmunohistochemistryResultsshowed that compared with the normal group，α-SMA and calpain antigen-positive cells of rat liver tissue in model group were significantly increased，distributing in liver parenchymal area.Compared with model group，in recovery model，α-SMA antigen-positive cells decreased.Calpain antigen-positive cells were mainly distributed in the liver lobule central vein，portal area，sinusoidal gap and other parts.Western blotResultsshowed that compared with the control group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were significantly enhanced in the model group.Compared with the model group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were decreased in spontaneous recovery after 2，4 and 8 weeks.ConclusionERS-related protein Caspase-12 might be related to the progression and regrossion of liver fibrosis.

liver fibrosis；endoplasmic reticulum stress；apoptosis；Calpain；Caspase-12

R 575.2

1000－1492（2015）02－0140－04

2014－12－12接收

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81102493、30873081）；國家教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項目（編號：20103420120001）；安徽醫(yī)科大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：201310366030）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院基礎(chǔ)與臨床藥理教研室、2肝病研究所，合肥 2300323安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，合肥230022

黃 艷，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師；李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn