預防使用氟康唑對頭孢哌酮引起的大鼠腸道真菌增殖和易位的影響

張帥民 羅湘蓉 石承先

（貴州省人民醫院，貴州 貴陽550002）

真菌是生物界中的一大類真核細胞微生物，部分真菌與人體共棲，維持微生態平衡。真菌感染的發病主要取決于宿主免疫狀態、宿主體內環境以及真菌毒力、數量等因素的相互作用。目前深部真菌感染在醫院感染中占重要地位，特別是近20多年來，尤其是抗生素廣泛使用，其持續上升趨勢明顯［1］，目前已成為住院患者感染及死亡的主要原因之一［2］。重癥 急 性 胰 腺 炎 （severe acute pancreatitis，SAP）病程合并深部真菌感染的發生率高達12%～24%［3］，而深部真菌感染也成為導致SAP高死亡率的重要原因之一［4］。在治療深部真菌感染策略［5］上目前主要有：經驗治療、目標治療以及預防性治療。經驗治療和目標治療多在診斷明確時采用抗真菌治療，此時真菌感染已經較為嚴重，控制較困難，死亡率仍然較高。臨床上預防性應用氟康唑治療真菌感染也取得了顯著成效，可明顯降低真菌感染率及死亡率［6］。在預防性用藥時機方面，建議使用抗生素6～9d后預防使用抗真菌藥物是合適的，并可明顯降低真菌感染、住院時間、治療費用和死亡率［7］。但是國內外學者對氟康唑在預防用藥的時間長短存在爭議［8］。本實驗通過使用抗生素后預防性使用氟康唑不同的時間，觀察對大鼠腸道真菌增殖及易位影響，以期為臨床上預防性使用真菌用藥時間提供實驗依據。

1 實驗方法

1.1 動物分組 Wistar大鼠30只，體質量200～250g，雌雄不拘，隨機分成三組，每組10只。三組大鼠每天均按體質量比例使用頭孢哌酮舒巴坦鈉直至取實驗動物標本，每組動物均在使用抗生素后第7天始分別加用生理鹽水或氟康唑行腹腔注射，生理鹽水使用3d為A組，氟康唑使用3d為B組，氟康唑使用5d為C組。

1.2 復制大鼠腸道真菌增殖及易位的模型 大鼠均為清潔級，在實驗前1周開始分籠飼養于貴陽中醫學院基礎實驗室動物房，清潔級恒溫（20～25℃）環境，標準鼠糧喂養，自由取水，實驗前飼養1周。開始實驗時每只鼠每天按體質量3.33g／kg［7］使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（cefoperazone sodium and sulbactam sodium，CSSS）至取標本前1d，用量分等量12h／次，每次用生理鹽水（normal saline，NS）稀釋抗生素至1mL，每次注射時大鼠腹部皮膚消毒，于大鼠右下腹部進針，有落空感回抽無尿液、腸液后固定針頭，緩慢注入藥液。A組于第7天每只鼠加用60mg／kg生理鹽水注射腹腔，連用3d后取標本，B、C組于第7天每只鼠加用60mg／kg氟康唑作腹腔注射，分別連用3d、5d后取標本，各組用量也分等量每1次／24h。各組動物給藥后的飼養均與實驗前相同。取標本前予大鼠戊巴比妥鈉按200mg／kg體質量皮下注射，麻醉生效后先予大鼠股靜脈采集血液1.5mL后用止血鉗止血，然后常規消毒鋪巾開腹，自下腔靜脈抽血2.0mL，然后取腸系膜、胰腺、肺組織及腸內容物作標本，最后用斷頭法處死大鼠。標本采集過程中均無菌操作。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 觀察動物的活動、精神狀況、體質量、大便性狀及顏色等。

1.3.2 腸內容物直接涂片鏡檢真菌 于大鼠肛門3cm處采集腸內容物1.0g左右，取腸內容物0.1g稀釋至100mL的生理鹽水（NS）中，用加樣槍吸取10uL滴在滅過菌的載玻片中央，將液滴涂布成一均勻的薄層；將標本玻片放于干燥箱干燥后，經酒精燈火焰處來回通過2～3次固定標本，待標本冷卻后行革蘭氏染色（初染→水洗→媒染→水洗→脫色→復染→水洗），待標本干燥后置于顯微鏡下查找真菌，查看相同視野范圍內各組真菌數量有無差異。

1.3.3 腸內容物真菌培養 分別取每只大鼠腸內容物0.1g稀釋至100mL NS中，取10μL接種于科瑪嘉顯色培養基中培養，37℃度孵箱培養2～3d后觀察結果。10μL接種時每克腸內容物真菌菌落數以培養基上真菌菌落數×106表示。

1.3.4 腸系膜、胰腺及肺組織培養 按無菌操作將腸系膜、胰腺、及肺組織適量取材后，分別放入營養肉湯試管培養基中，置于37℃孵箱中培養2～3d，如有微生物生長，將微生物轉移到科瑪嘉顯色培養基中予37℃孵箱培養2～3d后觀察有無真菌生長。

1.3.5 血液真菌培養 無菌操作，用一次性真空采血管自大鼠股靜脈采集血液1.5mL，將血液移至雙相血培養瓶行血培養，再將血培養瓶置于37℃孵箱培養2～3d后觀察結果。

1.3.6 血漿1－3－β－D葡聚糖檢測 無菌操作，自下腔靜脈采集血液2mL于無熱原肝素抗凝管，混勻，放入無熱原離心管中，用滅菌鋁箔封閉管口，然后使用低速離心機立刻進行3 000r／min離心，60s離心得富含血小板血漿，置于零下30℃冰箱保存，待批量檢測。取上述血小板血漿0.1mL加入裝有0.9mL樣品處理液中輕輕混勻后，70℃保溫10min，取出后立刻放入冷水浴中冷卻30℃以下，即為待測血漿樣品。取待測血漿樣品0.2mL加入酶反應主試劑中，待完全溶解后用加樣槍轉移至10mm×75mm標準玻璃反應管中（勿產生氣泡），立刻插入MD－80微生物動態檢測系統中進行反應，反應結束后自動計算血漿中1－3－β－D葡聚糖濃度，單位為pg／mL。廠家提供的對照血漿中真菌1－3－β－D葡聚糖（1－3－β－D glucan，1－3－G）正常值為＞20pg／mL。

1.4 數據處理 采用SPSS 17.0軟件進行數據處理。腸內容物真菌數量及血漿1－3－β－D葡聚糖水平經正態性檢驗和方差齊性檢驗后，用均數±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，腸系膜、胰腺、肺組織及血真菌培養結果采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。腸內真菌數量、器官真菌易位數及血漿1－3－G水平之間的關系用線性相關分析。

2 結 果

2.1 動物的一般情況 整個實驗過程中30只大鼠均存活。在動物的食量、活動以及體質量方面，A組明顯差于C組和B組；實驗期間稀便的總量A組多，B組次之，C組最少；在皮毛光滑方面C組最好，B組次之，A組最差。

2.2 腸內容物真菌培養及菌落鑒定情況 從菌落生長速度、大小、形態、質地、顏色、色素、菌落的邊緣、菌落的高度等方面來看，各組間無明顯差異，各組菌落經法國梅里埃AP120CAUX真菌測試條檢測為鄒褶念珠菌。

2.3 三組動物腸內容物真菌數量變化 從表1可見，三組動物使用抗生素后腸內容物真菌數均高于正常wistar大鼠腸道真菌數量［8］，與A組比較，B組和C組隨著氟康唑用藥天數的增加，大鼠腸道真菌數量顯著減少（P＜0.05），B組就減少到了A組的大約1／10，C組腸道真菌增殖又較B組減少明顯（P＜0.05），C組甚至接近正常值。

2.4 三組動物腸系膜、胰腺、肺組織及血液真菌培養情況 從表2可見，A組動物使用抗生素后，組織和血培養40份標本中，有26份標本培養為陽性；與A組比較，B組和C組真菌易位至腸外組織器官總數量隨著氟康唑的應用時間增加而顯著減少，其中C組又較B組減少明顯（P＜0.05）。

2.5 各組動物血漿1－3－G水平的變化 如表1，各組血漿1－3－G水平均大于正常值（＜20pg／mL），血漿1－3－G水平隨著氟康唑用藥天數的增加而降低，B組和C組均較A組明顯減少（P＜0.05），C組比B組顯著降低并接近正常動物參考值，與腸內容物真菌數量變化相一致。

2.6 腸真菌增殖、真菌腸外易位及血漿1－3－G水平之間的關系 如圖1～3，隨著腸道真菌增殖的增加，真菌易位至腸外組織器官總數和血漿1－3－β－D葡聚糖水平亦增加，腸道真菌增殖分別與真菌易位至腸外組織器官總數和血漿1－3－β－D葡聚糖水平呈正相關（r＝0.9230和0.943），真菌易位至腸外組織器官總數與血漿1－3－β－D葡聚糖水平亦呈正相關（r＝0.998）。

表1 三組大鼠使用不同時間氟康唑后腸道真菌的變化（±s）

表1 三組大鼠使用不同時間氟康唑后腸道真菌的變化（±s）

注：與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05。

359±64.20 82.25±6.84 B組 41.2±2.82＊ 49.48±5.70＊C組 4.5±1.49＊△ 25.64±6.79＊△正常參考值 3.89±2.52 ＜葡聚糖A組分組 腸內容真菌菌落數 血漿1－3－β－D 20.00

表2 三組大鼠使用不同時間氟康唑后器官真菌易位數

圖1 腸真菌增殖與血漿1－3－G水平的關系

圖3 腸道真菌易位至腸外各組織器官總數與血漿1－3－G水平的關系

3 討 論

3.1 抗生素與腸道真菌增殖及易位的關系 廣譜抗生素種類較多，若多種藥物聯用，療程過長等，可使腸道某些敏感細菌過度被抑制，非敏感細菌增殖，正常菌群的生態平衡遭到破壞，形成菌群替代現象，甚至導致真菌惡性繁殖并易位，發生真菌感染。因此抗生素引起腸道真菌感染及易位在臨床上較常見［9］。玉芳等［10］研究也證實：細菌主要對抗生素敏感，而抗生素直接抑制其增殖，這樣可能間接促進了真菌生長。目前引起腸道真菌感染最主要的致病菌是念珠菌［11］。有研究調查從血液科病人分離到的真菌中，來源于腸道排名第一，占64.4%［9］，提示患者發生真菌感染時，腸道真菌是其重要來源。本實驗發現大鼠使用抗生素后引起腸道真菌明顯增殖及易位，與李克躍等［7］的研究結果相一致。這些提示使用較長時間的抗生素后，腸道真菌明顯增殖，進而發生腸外組織器官易位，這可能是長時間使用抗生素后誘發深部真菌感染的重要原因之一。

3.2 腸道真菌增殖及易位與血漿1－3－G的關系1－3－β－D葡聚糖是一種多糖，除接合菌外普遍存在于真菌細胞壁中，占真菌細胞壁干重的50%以上［12］，而其他微生物如人體細胞、細菌、病毒均缺乏此成分。當真菌感染時，真菌可進入人體血液或移位到其他組織，其被吞噬細胞吞噬、消化等處理，1－3－β－D葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其他體液（如尿、腹水、胸水等）中1－3－β－D 葡聚糖含量增高。因此對1－3－β－D葡聚糖的動態檢測，有助于快速診斷深部真菌感染，選擇正確抗真菌藥物對癥治療［13］。本實驗顯示，血漿1－3－β－D 葡聚糖水平隨著腸道真菌增殖及真菌易位至腸外各組織器官總數的減少而降低，腸道真菌增殖和易位與血漿1－3－β－D葡聚糖水平呈正相關；各組血漿1－3－β－D葡聚糖均高于實驗正常值（＜20pg／mL），在A組當血漿1－3－β－D葡聚糖最高時腸道真菌易位至腸外組織器官的總數高達26個，而C組1－3－β－D葡聚糖接近正常值時，腸道真菌易位至腸外組織器官總數僅有9個。提示檢測血漿1－3－β－D葡聚糖含量有助于早期發現真菌感染。

3.3 預防使用氟康唑對腸道真菌增殖及易位的影響 預防性應用氟康唑可防止SAP發生真菌感染［6］，但使用多長時間比較合適無定論，如果使用時間長易引發耐藥并且也浪費，如果時間過短又達不到預防作用。本實驗表明預防性應用氟康唑3d后動物腸道真菌增殖明顯減少，5d時腸道真菌幾乎接近正常，腸道真菌易位至腸外組織的數量明顯減少，提示預防性使用氟康唑時間5d比較合適，這可能為我們在臨床工作中預防應用抗真菌藥物提供了實驗依據。

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