伊枯草菌素研究進(jìn)展

付雯　高永祥　張曉勇

摘 要：伊枯草菌素（iturin）是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種具有環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)的兩親化合物，其中伊枯草菌素A應(yīng)用最為廣泛。它具有溶血、表面活性和強(qiáng)烈的抗真菌特性，并且具有抗菌譜廣、低毒、低殘留和低過敏性的特點(diǎn)，其抗菌機(jī)制是同時(shí)作用于病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，是一種潛在的具有極大開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的生物農(nóng)藥。該文綜述了伊枯草菌素的應(yīng)用、作用機(jī)理及發(fā)酵研究方面的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：伊枯草菌素；生物農(nóng)藥；抗真菌

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）24-23-04

Research Progress of Iturin

Fu Wen1 et al.

（1Basic Medical College，Chengdu University of Tranditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）

Abstract：Iturin produced by Bacillus subtilis has cyclic lipoheptapeptides linked by a β-amino acid residue. Iturin A has been used mostly. It has hematolysis activity，strong antibiotic activity and moderate surfactant activity. Previous studies have shown that iturin could be used as a fungicide against various crop diseases. Iturin A poses little risk to the environment because of its low levels of toxicity and lack of allergic effects on the host. The mechanism of its antibiotic activity is the destruction of cell membrane and cell wall. It is a biopesticide with the great development and application value. This paper summarized the progress of iturin in application，the mechanism of antibiotic activity and fermentation.

Key words：Iturin；Biopesticide；Antibiotic activity

我國是農(nóng)業(yè)有害生物災(zāi)害發(fā)生較為嚴(yán)重的國家，而在有害生物所造成的損失中有80%是由植物病原真菌引起的。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織調(diào)查，如果不使用農(nóng)藥，全世界糧食總收成的50%左右將會(huì)被各種病、蟲、草、鼠害所吞噬。但是自20世紀(jì)以來，化學(xué)農(nóng)藥的大量應(yīng)用所帶來的食品安全和環(huán)境污染問題已十分嚴(yán)重，特別是絕大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥難以降解，殘留期長(zhǎng)，容易在食物鏈中積累，嚴(yán)重影響人類健康和生命安全[1]。伴隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)以及可持續(xù)發(fā)展觀點(diǎn)的提出，生物農(nóng)藥開始得到重視，并逐漸成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。

伊枯草菌素（iturin）是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種具有環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)的兩親化合物，疏水部分是β-氨基脂肪酸，由14～17個(gè)碳原子組成，親水部分為肽鏈，是7個(gè)α-氨基酸通過由脂肪酸的氨基與C-末端氨基酸的羧基形成的酰胺鍵成環(huán)[2]。伊枯草菌素家族（iturin lipopeptide family）包括伊枯草菌素A、桿菌抗霉素（Bacillomycin）L、D、F，抗霉枯草菌素（Mycosubtilin）和Bacilopeptins。所有的枯草芽孢桿菌都能夠產(chǎn)生伊枯草菌素。伊枯草菌素A是伊枯草家族中應(yīng)用最為廣泛的一種，它具有溶血，表面活性和強(qiáng)烈的抗真菌特性，并且具有抗菌譜廣，低毒，過敏反應(yīng)小的特點(diǎn)，是一種具有巨大應(yīng)用潛力的抗真菌制劑，目前已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、多種農(nóng)作物病害防治及果蔬保鮮等方面[3]。

1 伊枯草菌素的應(yīng)用

1.1 生物防治方面 伊枯草菌素具有廣譜抑制植物病原真菌的作用，對(duì)大部分的植物致病真菌都有很好的拮抗作用，而且它具有低毒的特點(diǎn)，因此伊枯草菌素可作為降低化學(xué)農(nóng)藥利用率的一種潛在的生物農(nóng)藥。S.Mizumoto[4]等將含有伊枯草菌素A的發(fā)酵液用于防治灰葡萄孢霉引起的番茄猝倒病，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有伊枯草菌素A的培養(yǎng)物能夠顯著地抑制番茄猝倒，而僅加入產(chǎn)生菌的對(duì)照并不能明顯抑制疾病的發(fā)生。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明純粹利用伊枯草菌素A產(chǎn)生菌進(jìn)行生物防治的效果不如含有伊枯草菌素A的發(fā)酵液，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素A噴施在土壤中還能有效地防止種子被病原菌殺死，而且在噴施了伊枯草菌素A 17d后土壤中已經(jīng)檢測(cè)不到它的存在，這相比于化學(xué)農(nóng)藥的高殘留而言，無疑更具有優(yōu)越性。而且即使施藥之后經(jīng)過比較長(zhǎng)時(shí)間菌體在土壤中已經(jīng)死亡，但是芽孢依然可以存活60d左右，當(dāng)芽孢再萌發(fā)形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，又可以具有一定的生防功能，因此伊枯草菌素A作為生物農(nóng)藥不僅沒有殘留而且藥效持久。此外，有研究表明伊枯草菌素對(duì)玉米葉枯病也有較好的防治作用[4]。在國內(nèi)已有將枯草芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)作為生物農(nóng)藥，防治水稻、小麥、辣椒、番茄、黃瓜等常見植物真菌病害，以及蚜蟲等蟲害的報(bào)道，并且研究還發(fā)現(xiàn)脂肽類生物農(nóng)藥能促進(jìn)辣椒和黃瓜的生長(zhǎng)，同時(shí)還能夠提高辣椒葉綠素的含量[5]。

1.2 采后真菌病害防治方面 M.Ongena[6]等將一株枯草芽孢桿菌應(yīng)用于蘋果采后的真菌防治，研究發(fā)現(xiàn)該菌能夠同時(shí)產(chǎn)生伊枯草菌素，fengycin（豐原素）和surfactin（表面活性素），而且無論是將該菌體還是其發(fā)酵上清液用于病原菌的防治，均能很好的降低疾病的發(fā)生。Arrebola等[7]證明伊枯草菌素還能夠有效地防治鱷梨、芒果等熱帶水果的真菌病害。王偉[8]等還將枯草芽孢桿菌用于葡萄灰霉菌的生物防治。齊東梅[9]等將枯草芽孢桿菌應(yīng)用于蘋果梨采后青霉病和黑斑病的防治，也取得了較好效果。Okigbo[10]還將枯草芽孢桿菌用于甘薯采后腐爛的防治，結(jié)果表明它能很好地防止腐爛發(fā)生。曹婷婷[11]等將枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物捷安肽素應(yīng)用于采后柑桔青綠霉菌的防治取得了較好的效果。許多實(shí)驗(yàn)表明伊枯草菌素和豐原素是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的最主要的抗真菌物質(zhì)[12]，而表面活性素對(duì)它們的抗真菌活性具有協(xié)同作用，因此枯草芽孢桿菌的3種脂肽混合使用可能更有助于真菌病害的防治。

1.3 醫(yī)療方面 由于伊枯草菌素為兩親化合物，它除了具有表面活性作用外，還具有溶血作用，對(duì)人紅血球和酵母菌原生質(zhì)體均有溶解作用。它是最早發(fā)現(xiàn)的具有抗菌活性的抗生素之一，早在20世紀(jì)50年代，伊枯草菌素A就用于治療人和動(dòng)物的皮膚真菌病，由于它具有廣譜抗真菌性、低毒以及低變態(tài)反應(yīng)的特點(diǎn)，使其成為了一種很有價(jià)值的抗真菌藥物。Bacillomycin F已在藥業(yè)和工業(yè)上注冊(cè)專利[13]，美國已有2個(gè)從Bacillus amyloliquefaciens中生產(chǎn)伊枯草菌素A用于防治霉菌病的專利。

2 伊枯草菌素作用機(jī)理

2.1 破壞病原菌的細(xì)胞膜 當(dāng)它作用于病原菌時(shí)，首先插入到細(xì)胞膜內(nèi)，然后自發(fā)聚集或是與膜脂類聚集形成寡聚結(jié)構(gòu)，形成離子通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量離子的流失，從而起到破壞病原菌的目的。實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)伊枯草菌素A作用于質(zhì)膜時(shí)，膜的導(dǎo)率G從10-8S·cm-2升高到10-3 S·cm-2，并且脂質(zhì)雙分子層上結(jié)合的伊枯草菌素越多，形成的微孔越多，導(dǎo)致離子的通透性越強(qiáng)，而且形成的離子通道并不相互作用，它們開放和關(guān)閉的轉(zhuǎn)換是固定的，同時(shí)這些離子通道還表現(xiàn)出對(duì)陰陽離子的選擇性[14]。研究還發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素之間的相互作用比與膜上脂質(zhì)的相互作用更強(qiáng)，而且伊枯草菌素可能形成一種完全相互交叉的雙層膜的微囊。曹婷婷[11]等發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素能夠迅速引起細(xì)胞膜損傷，致使細(xì)胞通透性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，達(dá)到抑制真菌孢子萌發(fā)、菌絲體生長(zhǎng)的效果。

2.2 破壞病原菌的細(xì)胞壁 當(dāng)伊枯草菌素作用于真菌時(shí)，可引起供試真菌呈現(xiàn)球形膨脹，而且隨著濃度的增大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，球形膨脹的程度和發(fā)生頻率也增加[15]。代富英[16]用同位素標(biāo)記法研究發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素可抑制細(xì)胞（1，3）-β-葡聚糖合成酶的活性，破壞真菌細(xì)胞壁的合成，造成真菌細(xì)胞壁組分（1，3）-β-D-葡聚糖的缺損，從而抑制病原真菌的生長(zhǎng)。

3 伊枯草菌素發(fā)酵研究進(jìn)展

3.1 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)伊枯草菌素 首次將固態(tài)發(fā)酵（SSF）應(yīng)用于伊枯草菌素發(fā)酵是在1992年，日本科學(xué)家Akihiro[17]將小麥麩皮作為發(fā)酵底物，其產(chǎn)量與液體發(fā)酵（SMF）相比提高了至少5倍（在相等體積下比較），不過研究者認(rèn)為伊枯草菌素的產(chǎn)生是發(fā)生在固態(tài)物質(zhì)水溶性界面，說明濕度對(duì)于產(chǎn)物的形成相當(dāng)重要，而且在此之前伊枯草菌素A的液體發(fā)酵至少需要5d，產(chǎn)量才能達(dá)到最大，而利用固態(tài)發(fā)酵2d即可達(dá)到最大產(chǎn)量。但實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通氣量和溫度的控制對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量的提高至關(guān)重要。之后伊枯草菌素的SSF發(fā)酵主要是以大豆殘?jiān)鳛榈孜铮琈izumoto等人利用響應(yīng)面法優(yōu)化了以大豆凝乳殘?jiān)鼮樵仙a(chǎn)伊枯草菌素A的條件，使伊枯草菌素A 的產(chǎn)量達(dá)到5.591mg/g豆渣濕重[18]。

大量實(shí)驗(yàn)表明SSF發(fā)酵生產(chǎn)伊枯草菌素比SMF具有更大的優(yōu)勢(shì)[19]：一是它需要的能量比液體發(fā)酵低，因?yàn)樗恍枰獢嚢柩b置，能耗低；二是它可用固態(tài)廢棄物作為發(fā)酵底物，生產(chǎn)成本低；三是傳統(tǒng)真菌的生產(chǎn)就是利用固態(tài)發(fā)酵，因此它有比較清楚的實(shí)踐基礎(chǔ)；四是對(duì)于產(chǎn)物提取來說，它產(chǎn)生的廢水較少，因此只需要較少的溶液進(jìn)行提取。

但固態(tài)發(fā)酵工藝目前還未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因?yàn)槭紫葲]有合適的設(shè)備用于工業(yè)化固態(tài)發(fā)酵，目前有的固態(tài)發(fā)酵設(shè)備主要有平板式，搖鼓式，包被床式，包被柱式和兩相空氣動(dòng)力改變裝置，它們都存在不能解決大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵的熱量擴(kuò)散和營(yíng)養(yǎng)，氧氣傳遞問題，其次是沒有放大的標(biāo)準(zhǔn)，最后是無法實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的實(shí)時(shí)檢測(cè)和控制。

3.2 深層液體發(fā)酵生產(chǎn)伊枯草菌素 關(guān)于伊枯草菌素優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法主要是金屬離子和氨基酸的添加實(shí)驗(yàn)。Yu-Hong Wei[20]等發(fā)現(xiàn)當(dāng)在伊枯草菌素的類似物表面活性素的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Mn2+和Fe2+時(shí)，其產(chǎn)量可提高至少8倍，但Fe2+的加入會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液酸化，從而使產(chǎn)物形成酸沉淀，因此在發(fā)酵過程中要不斷調(diào)整pH值，而伊枯草菌素的發(fā)酵還未見相關(guān)報(bào)道；研究發(fā)現(xiàn)L-Gln和L-Pro可促進(jìn)伊枯草菌素A的產(chǎn)生，而L-Lys和β-Ala對(duì)表面活性素產(chǎn)量的提高具有促進(jìn)作用。許錟[21]等依據(jù)氨基酸作為肽類抗生素的合成前體，在其生產(chǎn)期內(nèi)不僅能起抗生素合成單元的作用，還能誘導(dǎo)抗生素生物合成的理論，在發(fā)酵過程中添加多種氨基酸以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中添加Asn、Glu和Pro 3種氨基酸，可使產(chǎn)量提高28.6%。除了在基本培養(yǎng)基中添加特殊的金屬離子和氨基酸外，近幾年利用響應(yīng)面法優(yōu)化伊枯草發(fā)酵培養(yǎng)基也取得了很好的效果。趙鑫[22]等利用響應(yīng)面法優(yōu)化伊枯草菌素培養(yǎng)基，使伊枯草菌素A的產(chǎn)量達(dá)到52.21mg/mL，抗菌活性比之前提高了46.8%。Shih[23]等利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，使伊枯草菌素A的產(chǎn)量提高了180%，而單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)量?jī)H提高57%。

其發(fā)酵工藝技術(shù)也進(jìn)行了摸索。研究表明伊枯草菌素A雖然是在對(duì)數(shù)后期產(chǎn)生，但發(fā)酵第一天的通氣量和溫度至關(guān)重要。Baek-Seok[24]等報(bào)道了關(guān)于表面活性素發(fā)酵的一種新的通氣方法，即在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入氧載體過氧化氫，它在發(fā)酵過程中可分解為氧氣和水，同時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入植物油和硬脂酸鈣，作為消泡物質(zhì)和氧載體，這樣不僅可以很好的抑制泡沫，還能延長(zhǎng)產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)間，從而提高產(chǎn)量。Marlene[25]等人利用分批流加培養(yǎng)基的方法，使伊枯草菌素A的產(chǎn)量達(dá)到1.27mg/g生物干重。

泡沫分離技術(shù)已經(jīng)被成功的用于許多表面活性物質(zhì)的分離。Makoto[26]等利用泡沫分離手段發(fā)酵生產(chǎn)伊枯草菌素，他們發(fā)現(xiàn)其生產(chǎn)菌株產(chǎn)生的伊枯草菌素基本上都集中在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫里，因此通過收集泡沫，一是起到了將產(chǎn)物從發(fā)酵體系中連續(xù)移走，避免了產(chǎn)物反饋抑制；二是起到了消除泡沫對(duì)發(fā)酵的影響。但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量并沒有提高反而下降了，分析原因可能：（1）產(chǎn)物形成需要一定量的信號(hào)肽，而這些物質(zhì)與產(chǎn)物一起被泡沫所收集分離了；（2）菌體也隨著泡沫流失，減少了發(fā)酵液中的菌量，因此該發(fā)酵工藝還有待進(jìn)一步優(yōu)化，而且還需要對(duì)發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。

伊枯草菌素及其類似物如表面活性素都是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的，在發(fā)酵后期會(huì)產(chǎn)生大量的芽孢，而這時(shí)產(chǎn)物的形成會(huì)終止，因此Mohammad等利用這種現(xiàn)象，在發(fā)酵后期以半致死溫度熱刺激含有大量芽孢的發(fā)酵液10min后再補(bǔ)料培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)芽孢的二次萌發(fā)，使菌體再次生長(zhǎng)代謝形成產(chǎn)物，這種促孢子萌發(fā)的二次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)最終促進(jìn)了總產(chǎn)量的提高[27]。

3.3 固定化技術(shù)培養(yǎng)生產(chǎn)伊枯草菌素 固定化發(fā)酵技術(shù)具有發(fā)酵穩(wěn)定性好，產(chǎn)物提取方便等優(yōu)點(diǎn)。Mao-Sung[28]等采用在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入固相載體的固定化方法生產(chǎn)表面活性素的相關(guān)研究，并取得了較好的效果。分析原因一方面可能是因?yàn)檩d體促進(jìn)了菌的生長(zhǎng)，二是載體為菌提供了一種支撐作用，促進(jìn)了菌膜的形成，因此提高了產(chǎn)量，該法操作簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模培養(yǎng)。筆者利用固定化技術(shù)以木屑為載體并添加包埋劑海藻酸鈉的方法發(fā)酵生產(chǎn)伊枯草菌素類環(huán)脂肽物質(zhì)，可使產(chǎn)量比一般深層液態(tài)發(fā)酵提高46.58%[29]，該實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)之上利用Plackett-Burman Design（PBD）設(shè)計(jì)法篩選出固定化發(fā)酵關(guān)鍵影響因子，再利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)（Steepest Ascent Descent，SAD）和中心組合（Central Composite Designs，CCD）設(shè)計(jì)找出關(guān)鍵因子的最優(yōu)值最終使產(chǎn)量提高了41%[30-31]，同時(shí)利用中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化5L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)伊枯草菌素，使產(chǎn)量比單次分批發(fā)酵又提高了44%[32]，而且由于添加了固定化載體和包埋劑使發(fā)酵過程中泡沫溢出得到了較好的抑制。

3.4 淺層靜態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)伊枯草菌素 淺層生物膜發(fā)酵是一種較新的液體發(fā)酵方法，是伊枯草菌素發(fā)酵方法革新的巨大進(jìn)展[33]。其生產(chǎn)菌株為基因工程菌，該枯草芽孢桿菌能夠在液體培養(yǎng)基的表面產(chǎn)生較厚且穩(wěn)定的菌膜，在淺層靜態(tài)方式下培養(yǎng)，菌的生長(zhǎng)速度，產(chǎn)物形成速度和芽孢形成速度均慢于深層液態(tài)發(fā)酵，但是最終的總菌量與深層液態(tài)培養(yǎng)并沒有差異。該發(fā)酵方法雖然產(chǎn)素周期延長(zhǎng)，但是由于其生長(zhǎng)代謝活性狀態(tài)能夠維持更長(zhǎng)時(shí)間且提高了菌對(duì)底物的有效利用，其產(chǎn)量反而高于深層液態(tài)發(fā)酵。而且形成生物膜上的細(xì)胞更不易于形成孢子，因?yàn)樵诖梭w系中，氧氣的傳遞受到一定的限制，不會(huì)使菌體的超量增長(zhǎng)引起底物的缺乏。目前已經(jīng)開展了對(duì)枯草芽孢桿菌生物膜形成的過程、特征及分子調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究[34]，有望進(jìn)一步提高淺層液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)伊枯草菌素的產(chǎn)量。

4 展望

盡管有研究表明枯草芽孢桿菌可能涉及一些食物中毒事件，但它對(duì)人體的毒性是很低的，而且事實(shí)上它并不是人體的致病菌，目前主要實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的也是它的發(fā)酵產(chǎn)物伊枯草菌素，因此把枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物伊枯草菌素作為抗真菌物質(zhì)，不僅具有環(huán)境友好性，而且對(duì)人體也沒有傷害，將其作為生物農(nóng)藥或抗真菌藥物具有極大的開發(fā)應(yīng)用前景[35]。但是相比于一些化學(xué)合成的抗真菌藥物而言，伊枯草菌素并沒能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，究其原因還是常規(guī)發(fā)酵產(chǎn)量較低，而高發(fā)酵產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本過高。目前隨著基因工程技術(shù)的不斷提高，已經(jīng)有人利用基因工程的方法將HpaGXooc，一種能夠激發(fā)非寄主植物的過敏性細(xì)胞壞死，誘導(dǎo)植物抗病、抗蟲和抗旱，同時(shí)促進(jìn)植物生長(zhǎng)的非特異性蛋白激發(fā)子的基因轉(zhuǎn)化B. subtilis OKB105，并得到了基因工程菌株OKBHF，研究發(fā)現(xiàn)它能夠更好的誘導(dǎo)植物抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5]。因此隨著伊枯草菌素相關(guān)基因研究的不斷深入以及枯草芽孢桿菌和寄主植物之間相互作用的分子機(jī)制的不斷深入，通過分子誘變育種、生物合成結(jié)構(gòu)類似物、提高產(chǎn)物分離效率和簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝同時(shí)提高發(fā)酵產(chǎn)量等手段，最終可以達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)伊枯草菌素的目的。

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（責(zé)編：張宏民）