解磷巨大芽孢桿菌JL—1發酵條件的初步優化

梁曉輝+龍小軍+趙豐+龍智文+李信冬+竇培沖

摘 要：該文對解磷巨大芽孢桿菌JL-1生長的影響因素及生長特性進行了實驗研究。單因子實驗結果顯示，菌株生長的最適溫度為25～30℃，最適pH為6.0～7.0，接種量為5%，裝液量為50mL/250mL；正交優化實驗結果顯示，各因素中對解磷菌JL-1生長影響的大小依次為：溫度>pH>接種量>裝液量，最優組合為溫度30℃、起始pH6.0、接種量6%、裝液量40mL/250mL，該條件下培養物中的菌體密度達到了3.98×109cfu/mL。

關鍵詞：解磷巨大芽孢桿菌JL-1；發酵條件；初步優化

中圖分類號 Q789 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）24-27-03

磷是植物生長所必需的礦質元素之一，植物的光合作用和體內的生化過程都必須有磷元素參與[1]。然而我國耕地土壤磷素狀況卻不容樂觀，有資料顯示，我國約有74%的耕地土壤缺磷，且土壤中95%以上的磷為無效態磷[2]。國外有研究表明，自然界存在相當數量具有解磷作用的微生物，包括解磷細菌、解磷真菌、解磷放線菌等幾大類，主要分布在根際土壤中，它們能夠把土壤中不溶性磷轉化為可供植物利用的可溶性磷，而植物根系能夠為這些解磷微生物提供生長所必須的糖類等有機碳[3]，這層關系的發現促生了新的生物技術的出現，如利用解磷菌制成生物有機肥用于農業，以提高作物的產量[4]。我國也有相關的研究，如劉麗麗、郜春花等[5～6]的研究表明，解磷微生物可使小麥、燕麥等增產，能夠促進作物對肥料和土壤磷素的吸收。

本實驗室從土壤中分離到一株具有解磷作用的巨大芽孢桿菌，初步實驗顯示，其能夠顯著增加土壤中的可溶性磷含量，在生物有機肥生產中具有重要的應用價值。本研究擬對其液態發酵條件進行優化，以獲得高密度的菌液，為巨大芽孢桿菌在發酵生產中的應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種：巨大芽孢桿菌JL-1，由本實驗室自行分離保存。培養基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、瓊脂30g/L、NaCl5g/L，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將斜面種子接入液體培養基，30℃、170r/min振蕩培養24h，以5%（v/v，下同）接種量轉入新的培養基中30℃、170r/min振蕩培養12h至對數期得到種子液。

1.2.2 液體發酵產酶條件的研究 對影響巨大芽孢桿菌生長的溫度、培養基初始pH、接種量、裝液量、搖床轉速等因素進行單因子實驗，再選擇影響較大的因素進行正交優化，最終獲得菌株JL-1的最佳培養條件。

1.2.3 菌株JL-1生長量的測定 采用OD600標示菌株的生長量，細胞密度計數采用涂平板法。

2 結果分析

2.1 單因子實驗結果

2.1.1 培養溫度的影響 向250mL三角瓶中裝入45mL培養基，接入5mL種子液，分別于不同的溫度下進行培養，搖床轉速均為170r/m，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。從圖1可以看出，菌株JL-1生長的最適溫度在25～30℃，此時培養物的吸光值為0.985～1.035，超出這一范圍時，菌體密度均有不同程度的下降，其中在20℃時，培養物吸光值為0.851，15℃時，培養物吸光值下降為0.512；當培養溫度高于30℃時，菌體密度迅速下降，35℃時，吸光值為0.731，40℃時培養物吸光值僅有0.22。

圖1 培養溫度對菌株JL-1生長的影響

2.1.2 pH對菌株JL-1生長的影響 向250mL三角瓶中裝入45mL培養基，調節其初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接入5mL種子液，于30℃、170 r/m條件下培養，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。從圖2可以看出，pH對菌株JL-1的生長有明顯的影響，最適生長pH為6.0～7.0，培養物吸光值為0.981～0.952，說明菌株適合在微酸的環境中生長，超出這一范圍時，菌體生長量均有不同程度的下降，如當培養基初始pH為4.0，培養物的吸光值下降為0.42，相比之下，堿性環境對菌株JL-1生長的影響更為明顯，如當培養基初始pH為9.0時，培養物的吸光值僅有0.15，菌株生長收到了極大的抑制。

圖2 pH對菌株JL-1生長的影響

2.1.3 接種量對JL-1生長的影響 取5組250mL三角瓶，裝入適量的培養基，調節其初始pH為6.0，分別接入1%、3%、5%、7%、9%的種子液，使三角瓶中總裝液量為50mL，于30℃、170r/m條件下培養，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。從圖3可以看出，隨著接種量的增加，菌株JL-1的生長量逐漸增加，當接種量為5%時，培養物的吸光值達到0.958；之后繼續增加接種量，菌株生長量的增加不明顯，可見在發酵菌株JL-1時接種量達到5%即可。

圖3 接種量對菌株JL-1生長的影響

2.1.4 裝液量對菌株JL-1生長的影響 取7組250mL三角瓶，裝入適量的培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，使三角瓶中總裝液量分別為20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL，于30℃、170r/m條件下培養，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。從圖4可以看出，隨著裝液量的增加，菌株JL-1的生長量先增加后減少，當裝液量為50mL時，生長量達最大值，培養物的吸光值為0.951，可見在發酵菌株JL-1時裝液量以50mL/250mL為宜。裝液量的多少決定了微生物細胞接觸空氣機會的多少和收到機械創傷力的大小，當裝液量較少時，雖然細胞更多的機會接觸到空氣，細胞同時也受到了較大的機械創傷力，隨著裝液量的增加，細菌細胞所受到的機械創傷力減小，與空氣接觸機會的多少對生長的影響起了主導作用，2種因素相互作用，使50mL的裝液量成為一個最佳結合點。

圖4 裝液量對菌株JL-1生長的影響

2.1.5 搖床轉速對菌株JK-1生長的影響 取4組250mL三角瓶，裝入45mL培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，培養溫度為30℃，分別于70r/min、120r/min、170r/min、220r/min條件下培養，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。由圖5可知，隨著搖床轉速的增加，菌株JL-1的生長量也在不斷增加，這是因為轉速的增加，使得細菌細胞接觸空氣的幾率增大，這亦可說明菌株JL-1是一株好氧菌，但搖床轉速的增加也加大了菌體細胞所受到機械創傷力，考慮到搖床自身性能的限制，轉速應不超過220r/min。

圖5 搖床轉速對菌株JL-1生長的影響

2.2 菌株JL-1生長曲線的測定 向250mL三角瓶中裝入45mL培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，于30℃，220r/min條件下培養，每隔2h取樣1次，測定培養物的吸光值（OD600）。共做3個重復，吸光值取平均值。從圖6可以看出，接種后的前2h為生長的延滯期，隨后進入對數生長期，培養14～18h間為穩定期，其培養物的吸光值維持在0.978～0.997，18h后吸光值有所下降，進入衰亡期，因此，為獲得最大數量菌體，將菌株培養14h即可。

圖6 菌株JL-1生長曲線的測定

2.3 正交優化實驗 對其他因素即溫度、起始pH、接種量、裝液量進行正交優化實驗，采用L9（34）正交表，表頭設計及實驗結果分別見表1、表2。

表1 正交實驗因素水平

[序號＼&A溫度（℃）＼&B起始（pH）＼&C接種量（%）＼&D裝液量（mL）＼&1＼&25＼&5＼&4＼&40＼&2＼&30＼&6＼&5＼&50＼&3＼&35＼&7＼&6＼&60＼&]

表2 正交實驗結果

[試驗號＼&A＼&B＼&C＼&D＼&＼&1＼&25＼&5＼&4＼&40＼&0.851＼&2＼&25＼&6＼&5＼&50＼&1.02＼&3＼&25＼&7＼&6＼&60＼&0.954＼&4＼&30＼&5＼&5＼&60＼&0.861＼&5＼&30＼&6＼&6＼&40＼&1.153＼&6＼&30＼&7＼&4＼&50＼&1.054＼&7＼&35＼&5＼&6＼&50＼&0.732＼&8＼&35＼&6＼&4＼&60＼&0.839＼&9＼&35＼&7＼&5＼&40＼&0.767＼&K1＼&2.825＼&2.444＼&2.744＼&2.771＼&＼&K2＼&3.068＼&3.012＼&2.648＼&2.806＼&＼&K3＼&2.338＼&2.775＼&2.839＼&2.654＼&＼&k1＼&0.942＼&0.815＼&0.915＼&0.924＼&＼&k2＼&1.023＼&1.004＼&0.883＼&0.935＼&＼&k3＼&0.780＼&0.925＼&0.946＼&0.885＼&＼&R＼&0.240＼&0.190＼&0.064＼&0.051＼&＼&]

極差分析顯示，試驗各因素中對菌株JL-1生長影響最大的是溫度，其它依次為起始pH、接種量、裝液量，最優組合為A2B2C3D1，在此條件下對菌株JL-1的生長進行試驗，結果顯示，該條件下3個重復的吸光值分別為1.281、1.309、1.323，平均值為1.304，高于任何實驗組，說明優化實驗得到了較好的效果。通過平板計數得知，此時培養物中的細胞數量達到了3.98×109cfu/mL（表3）。

表3 優化條件下活菌的計數

[重復＼&吸光值（OD600）＼&活菌數（×109cfu/mL）＼&重復1＼&1.281＼&4.15＼&重復2＼&1.309＼&3.97＼&重復3＼&1.323＼&3.82＼&平均＼&1.304＼&3.98＼&]

3 結論與討論

巨大芽孢桿JL-1是一株重要的解磷細菌，在生物有機肥的生產上有著重要的應用價值。本文對其生長的影響因素及生長特性進行了研究，得到如下結論：（1）單因子實驗結果顯示，菌株JL-1生長的最適溫度為25～30℃，最適pH為6.0～7.0，接種量為5%，裝液量為50mL/250mL，搖床轉速為220r/min。菌株JL-1接種后2h進入對數生長期，14～18h為穩定期。（2）正交實驗結果顯示，各因素中對解磷菌JL-1生長影響的大小依次為：A>B>C>D，最優組合為A2B2C3D1，該條件下培養物中的菌體密度達到了3.98×109cfu/mL。（3）從實驗結果來看，菌株JL-1是一株好氧菌，培養基中的溶氧對其生長具有明顯的影響，若應用于工業生產，為獲得高細胞密度發酵產物仍需對其攪拌速率、通氣量等因素作進一步的研究。

參考文獻

[1]何玉龍，周青平.解磷微生物研究進展[J].青海畜牧獸醫雜志，2012，42（2）：36-38.

[2]楊艷菊，王改蘭，張海鵬，等.解磷微生物的研究現狀及在農業上[J].湖南農業科學，2012（11）：23-25.

[3]A.Deubel，A.Gransee，W.Merbach.Transformation of organic rhizodeposits by rhizoplane bacteria and its influence on the availability of tertiary calcium phosphate[J].Plant Nutrition Soil Sci.，2000，163：387-392.

[4]R.K.Gothwal，V.K.Nigam，M.K. Mohan，D.Sasmal，P.Ghosh. Phosphate solubilization by rhizospheric bacterial isolates from economically important desert plants[J] Indian Microbiol.，2006，46（4）：355-361.

[5]劉麗麗，陳立新，王廣朝.9320-SD系列菌的溶磷研究[J].南開大學學報，1998，31（3）：75-79.

[6]郜春花，王崗，董云中.解磷菌劑盆栽及大田施用效果[J].山西農業科學，2003，31（3）：40-43.

（責編：張宏民）

圖4 裝液量對菌株JL-1生長的影響

2.1.5 搖床轉速對菌株JK-1生長的影響 取4組250mL三角瓶，裝入45mL培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，培養溫度為30℃，分別于70r/min、120r/min、170r/min、220r/min條件下培養，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。由圖5可知，隨著搖床轉速的增加，菌株JL-1的生長量也在不斷增加，這是因為轉速的增加，使得細菌細胞接觸空氣的幾率增大，這亦可說明菌株JL-1是一株好氧菌，但搖床轉速的增加也加大了菌體細胞所受到機械創傷力，考慮到搖床自身性能的限制，轉速應不超過220r/min。

圖5 搖床轉速對菌株JL-1生長的影響

2.2 菌株JL-1生長曲線的測定 向250mL三角瓶中裝入45mL培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，于30℃，220r/min條件下培養，每隔2h取樣1次，測定培養物的吸光值（OD600）。共做3個重復，吸光值取平均值。從圖6可以看出，接種后的前2h為生長的延滯期，隨后進入對數生長期，培養14～18h間為穩定期，其培養物的吸光值維持在0.978～0.997，18h后吸光值有所下降，進入衰亡期，因此，為獲得最大數量菌體，將菌株培養14h即可。

圖6 菌株JL-1生長曲線的測定

2.3 正交優化實驗 對其他因素即溫度、起始pH、接種量、裝液量進行正交優化實驗，采用L9（34）正交表，表頭設計及實驗結果分別見表1、表2。

表1 正交實驗因素水平

[序號＼&A溫度（℃）＼&B起始（pH）＼&C接種量（%）＼&D裝液量（mL）＼&1＼&25＼&5＼&4＼&40＼&2＼&30＼&6＼&5＼&50＼&3＼&35＼&7＼&6＼&60＼&]

表2 正交實驗結果

[試驗號＼&A＼&B＼&C＼&D＼&＼&1＼&25＼&5＼&4＼&40＼&0.851＼&2＼&25＼&6＼&5＼&50＼&1.02＼&3＼&25＼&7＼&6＼&60＼&0.954＼&4＼&30＼&5＼&5＼&60＼&0.861＼&5＼&30＼&6＼&6＼&40＼&1.153＼&6＼&30＼&7＼&4＼&50＼&1.054＼&7＼&35＼&5＼&6＼&50＼&0.732＼&8＼&35＼&6＼&4＼&60＼&0.839＼&9＼&35＼&7＼&5＼&40＼&0.767＼&K1＼&2.825＼&2.444＼&2.744＼&2.771＼&＼&K2＼&3.068＼&3.012＼&2.648＼&2.806＼&＼&K3＼&2.338＼&2.775＼&2.839＼&2.654＼&＼&k1＼&0.942＼&0.815＼&0.915＼&0.924＼&＼&k2＼&1.023＼&1.004＼&0.883＼&0.935＼&＼&k3＼&0.780＼&0.925＼&0.946＼&0.885＼&＼&R＼&0.240＼&0.190＼&0.064＼&0.051＼&＼&]

極差分析顯示，試驗各因素中對菌株JL-1生長影響最大的是溫度，其它依次為起始pH、接種量、裝液量，最優組合為A2B2C3D1，在此條件下對菌株JL-1的生長進行試驗，結果顯示，該條件下3個重復的吸光值分別為1.281、1.309、1.323，平均值為1.304，高于任何實驗組，說明優化實驗得到了較好的效果。通過平板計數得知，此時培養物中的細胞數量達到了3.98×109cfu/mL（表3）。

表3 優化條件下活菌的計數

[重復＼&吸光值（OD600）＼&活菌數（×109cfu/mL）＼&重復1＼&1.281＼&4.15＼&重復2＼&1.309＼&3.97＼&重復3＼&1.323＼&3.82＼&平均＼&1.304＼&3.98＼&]

3 結論與討論

巨大芽孢桿JL-1是一株重要的解磷細菌，在生物有機肥的生產上有著重要的應用價值。本文對其生長的影響因素及生長特性進行了研究，得到如下結論：（1）單因子實驗結果顯示，菌株JL-1生長的最適溫度為25～30℃，最適pH為6.0～7.0，接種量為5%，裝液量為50mL/250mL，搖床轉速為220r/min。菌株JL-1接種后2h進入對數生長期，14～18h為穩定期。（2）正交實驗結果顯示，各因素中對解磷菌JL-1生長影響的大小依次為：A>B>C>D，最優組合為A2B2C3D1，該條件下培養物中的菌體密度達到了3.98×109cfu/mL。（3）從實驗結果來看，菌株JL-1是一株好氧菌，培養基中的溶氧對其生長具有明顯的影響，若應用于工業生產，為獲得高細胞密度發酵產物仍需對其攪拌速率、通氣量等因素作進一步的研究。

參考文獻

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[2]楊艷菊，王改蘭，張海鵬，等.解磷微生物的研究現狀及在農業上[J].湖南農業科學，2012（11）：23-25.

[3]A.Deubel，A.Gransee，W.Merbach.Transformation of organic rhizodeposits by rhizoplane bacteria and its influence on the availability of tertiary calcium phosphate[J].Plant Nutrition Soil Sci.，2000，163：387-392.

[4]R.K.Gothwal，V.K.Nigam，M.K. Mohan，D.Sasmal，P.Ghosh. Phosphate solubilization by rhizospheric bacterial isolates from economically important desert plants[J] Indian Microbiol.，2006，46（4）：355-361.

[5]劉麗麗，陳立新，王廣朝.9320-SD系列菌的溶磷研究[J].南開大學學報，1998，31（3）：75-79.

[6]郜春花，王崗，董云中.解磷菌劑盆栽及大田施用效果[J].山西農業科學，2003，31（3）：40-43.

（責編：張宏民）

圖4 裝液量對菌株JL-1生長的影響

2.1.5 搖床轉速對菌株JK-1生長的影響 取4組250mL三角瓶，裝入45mL培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，培養溫度為30℃，分別于70r/min、120r/min、170r/min、220r/min條件下培養，16h后取樣測定培養物的吸光值（OD600），每個溫度做3個重復，吸光值取平均值。由圖5可知，隨著搖床轉速的增加，菌株JL-1的生長量也在不斷增加，這是因為轉速的增加，使得細菌細胞接觸空氣的幾率增大，這亦可說明菌株JL-1是一株好氧菌，但搖床轉速的增加也加大了菌體細胞所受到機械創傷力，考慮到搖床自身性能的限制，轉速應不超過220r/min。

圖5 搖床轉速對菌株JL-1生長的影響

2.2 菌株JL-1生長曲線的測定 向250mL三角瓶中裝入45mL培養基，調節其初始pH為6.0，接入5%的種子液，于30℃，220r/min條件下培養，每隔2h取樣1次，測定培養物的吸光值（OD600）。共做3個重復，吸光值取平均值。從圖6可以看出，接種后的前2h為生長的延滯期，隨后進入對數生長期，培養14～18h間為穩定期，其培養物的吸光值維持在0.978～0.997，18h后吸光值有所下降，進入衰亡期，因此，為獲得最大數量菌體，將菌株培養14h即可。

圖6 菌株JL-1生長曲線的測定

2.3 正交優化實驗 對其他因素即溫度、起始pH、接種量、裝液量進行正交優化實驗，采用L9（34）正交表，表頭設計及實驗結果分別見表1、表2。

表1 正交實驗因素水平

[序號＼&A溫度（℃）＼&B起始（pH）＼&C接種量（%）＼&D裝液量（mL）＼&1＼&25＼&5＼&4＼&40＼&2＼&30＼&6＼&5＼&50＼&3＼&35＼&7＼&6＼&60＼&]

表2 正交實驗結果

[試驗號＼&A＼&B＼&C＼&D＼&＼&1＼&25＼&5＼&4＼&40＼&0.851＼&2＼&25＼&6＼&5＼&50＼&1.02＼&3＼&25＼&7＼&6＼&60＼&0.954＼&4＼&30＼&5＼&5＼&60＼&0.861＼&5＼&30＼&6＼&6＼&40＼&1.153＼&6＼&30＼&7＼&4＼&50＼&1.054＼&7＼&35＼&5＼&6＼&50＼&0.732＼&8＼&35＼&6＼&4＼&60＼&0.839＼&9＼&35＼&7＼&5＼&40＼&0.767＼&K1＼&2.825＼&2.444＼&2.744＼&2.771＼&＼&K2＼&3.068＼&3.012＼&2.648＼&2.806＼&＼&K3＼&2.338＼&2.775＼&2.839＼&2.654＼&＼&k1＼&0.942＼&0.815＼&0.915＼&0.924＼&＼&k2＼&1.023＼&1.004＼&0.883＼&0.935＼&＼&k3＼&0.780＼&0.925＼&0.946＼&0.885＼&＼&R＼&0.240＼&0.190＼&0.064＼&0.051＼&＼&]

極差分析顯示，試驗各因素中對菌株JL-1生長影響最大的是溫度，其它依次為起始pH、接種量、裝液量，最優組合為A2B2C3D1，在此條件下對菌株JL-1的生長進行試驗，結果顯示，該條件下3個重復的吸光值分別為1.281、1.309、1.323，平均值為1.304，高于任何實驗組，說明優化實驗得到了較好的效果。通過平板計數得知，此時培養物中的細胞數量達到了3.98×109cfu/mL（表3）。

表3 優化條件下活菌的計數

[重復＼&吸光值（OD600）＼&活菌數（×109cfu/mL）＼&重復1＼&1.281＼&4.15＼&重復2＼&1.309＼&3.97＼&重復3＼&1.323＼&3.82＼&平均＼&1.304＼&3.98＼&]

3 結論與討論

巨大芽孢桿JL-1是一株重要的解磷細菌，在生物有機肥的生產上有著重要的應用價值。本文對其生長的影響因素及生長特性進行了研究，得到如下結論：（1）單因子實驗結果顯示，菌株JL-1生長的最適溫度為25～30℃，最適pH為6.0～7.0，接種量為5%，裝液量為50mL/250mL，搖床轉速為220r/min。菌株JL-1接種后2h進入對數生長期，14～18h為穩定期。（2）正交實驗結果顯示，各因素中對解磷菌JL-1生長影響的大小依次為：A>B>C>D，最優組合為A2B2C3D1，該條件下培養物中的菌體密度達到了3.98×109cfu/mL。（3）從實驗結果來看，菌株JL-1是一株好氧菌，培養基中的溶氧對其生長具有明顯的影響，若應用于工業生產，為獲得高細胞密度發酵產物仍需對其攪拌速率、通氣量等因素作進一步的研究。

參考文獻

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[4]R.K.Gothwal，V.K.Nigam，M.K. Mohan，D.Sasmal，P.Ghosh. Phosphate solubilization by rhizospheric bacterial isolates from economically important desert plants[J] Indian Microbiol.，2006，46（4）：355-361.

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[6]郜春花，王崗，董云中.解磷菌劑盆栽及大田施用效果[J].山西農業科學，2003，31（3）：40-43.

（責編：張宏民）