口服二乙基亞硝胺誘導建立同系小鼠肝硬化模型

譚嘉鑫，游 逾，曾林立，賴潔娟，張玉君，別 平，白蓮花

（第三軍醫大學西南醫院肝膽外科，重慶400030）

口服二乙基亞硝胺誘導建立同系小鼠肝硬化模型

譚嘉鑫，游 逾，曾林立，賴潔娟，張玉君，別 平，白蓮花

（第三軍醫大學西南醫院肝膽外科，重慶400030）

目的 嘗試采用二乙基亞硝胺（DEN）喂飼小鼠成功誘導和建立小鼠肝硬化模型。方法 選取純系C57BL/6小鼠60只，隨機分為實驗組和對照組，各30只。實驗組小鼠喂飼含DEN的飲水誘發肝硬化，對照組小鼠喂飼蒸餾水。采用HE染色、Masson染色等方法觀察兩組小鼠肝臟組織形態、纖維化，并連續30 d監測兩組小鼠體質量變化，用行為學方法觀察兩組小鼠的自主運動差異判斷其精神狀態變化。結果 隨著喂飼DEN時間的增加，HE染色和Masson染色均顯示實驗組小鼠肝臟纖維化組織增生，肝硬化程度逐漸加重，各時間點的半定量評分系統評分與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。實驗組小鼠的體質量隨著DEN喂飼時間的增加而明顯降低，而對照組小鼠的體質量卻略有增加，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組小鼠的運動總路程少于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 DEN喂飼可誘發C57BL/6小鼠逐漸從肝纖維化到肝硬化，最終成功建立了前所未有的可作為研究人類肝硬化的一種理想動物模型。

二乙基亞硝胺； 肝硬化/病理學； 小鼠； 模型； 誘導

肝硬化是臨床常見慢性進行性肝病，常由肝纖維化演變而來，最終發展為肝癌，嚴重危害人類健康。初期增生的肝臟纖維組織形成小的條索，尚未互相連接形成纖維間隔而改建肝小葉結構時，為肝纖維化。其實質是細胞外基質（ECM）的合成率大于降解率，在肝臟內過度沉積的病理學改變，加重之后發展為肝硬化。隨著研究不斷深入，學者對肝硬化的發病機制有了更加深入的認識，并提出肝纖維化甚至肝硬化可能逆轉的觀點[1-2]。因此，建立肝硬化動物模型是肝硬化研究的必要條件。目前，研究肝硬化的同系動物模型缺乏。本研究采用喂飼二乙基亞硝胺（DEN）建立小鼠肝硬化模型，旨在探討該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 純系C57BL/6小鼠60只，雌性和雄性各30只；8～10周齡；體質量為20～22 g。均購自第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心，購回后無特定病原體級適應性喂養2 d。DEN購自美國sigma公司。

1.2 方法 將60只小鼠隨機分為實驗組和對照組，各30只。將0.14 mL DEN溶于1 000 mL滅菌水（濃度為133 μg/mL），配成 DEN溶液。實驗組小鼠連續喂飼6d DEN溶液，然后喂飼1 d蒸餾水，如此循環。對照組小鼠僅喂飼蒸餾水。分別于飼喂第4、6、8、10、12周脫頸處死實驗組和對照組小鼠，每組每次6只，采集肝臟標本。取肝左葉，迅速置于10%甲醛溶液固定3 d，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。行HE染色與Masson染色檢測。采用Chevallier等[3]的半定量評分系統（SSS）對小鼠肝纖維化程度進行評分。造模第1～30天，每天定時測量小鼠體質量。造模第8周時，在實驗組和對照組中各隨機選取6只小鼠進行曠場實驗，利用曠場設備觀察記錄分析小鼠的自發性活動、應激及探索習性。實驗開始前2 d，將小鼠置入行為實驗室適應整體環境。正式實驗時，將小鼠置于大小為25 cm×25 cm×32 cm的插板式實驗場中，任其自由活動10 min，嚴格避免聲音和光線刺激。曠場設備攝像頭追蹤記錄小鼠運動軌跡，利用其軟件分析小鼠運動總路程。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組小鼠肝組織病理學檢查情況 在第11周時實驗組死亡1例小鼠。對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊，肝竇正常，未見異常肝細胞及纖維組織增生。實驗組小鼠第4周肝小葉結構較清晰，少量纖維組織增生；第6周肝小葉結構較完整，纖維組織輕度增生；第8周肝小葉中央靜脈增厚，纖維組織明顯增生；第10、12周肝臟大量纖維組織增生，假小葉出現，肝硬化形成。見圖1、2。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學檢查結果（HE染色，200×）

2.2 兩組小鼠SSS分數比較 實驗組小鼠第4、6、8、10、12周SSS分數分別為（1.17±0.41）、（3.83±1.47）、（12.16± 1.72）、（18.50±1.87）、（22.33±0.81）分；對照組小鼠分別為（0.40±0.17）、（0.40±0.17）、（0.51±0.33）、（0.51±0.33）分、（0.51±0.33）分。兩組小鼠第4、6、8、10、12周SSS分數比較，差異均有統計學意義（t=4.254、5.688、16.316、23.212、62.549，P＜0.05）。

圖2 兩組小鼠肝組織病理學檢查結果（Masson染色，200×）

2.3 兩組小鼠體質量變化情況比較 對照組小鼠第1～30天體質量隨喂飼時間延長逐漸增加，實驗組小鼠體質量逐漸下降，兩組體質量變化呈線性趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 兩組小鼠第1～30天體質量變化

2.4 兩組小鼠曠場實驗情況比較 對照組小鼠運動總路程為（20 140±2 156）mm，顯著多于實驗組小鼠的（16 384±2 738）mm，兩組比較，差異有統計學意義（t= 2.64，P＜0.05）。

3 討 論

肝細胞受損后，會引起肝細胞的壞死、再生、發生局灶性肝纖維化，進而發生肝硬化[4]。在中國，乙型肝炎病毒感染為肝硬化的主要起因[5-6]。肝臟損傷持續存在，組織發生修復反應時因細胞外基質合成速度大于降解速度，引起纖維結締組織增生，稱為肝纖維化，當其進一步發展引起肝小葉改建，有假小葉及結節形成時則稱為肝硬化，最后演變為肝癌[7-8]。肝硬化為肝癌的前置病變。為早期防治肝硬化提供理想的動物模型具有重要意義。

目前，制備肝硬化模型的方法較多，應用較為廣泛的動物模型有化學性肝硬化、營養性硬化、酒精性肝硬化、免疫性肝硬化、膽總管結扎致肝硬化、血吸蟲性肝硬化等。每種造模方法致病因素不同，誘導肝硬化的機制、穩定性、重復性也不同。文獻中對小鼠誘發性肝硬化模型報道較少，雖有報道用四氯化碳（CC14）和乙醇能誘發小鼠肝硬化[9-10]，但成功率不高，卻在誘發過程中小鼠死亡率很高；也有報道用CC14腹腔注射的方法誘導小鼠肝硬化[11]。有報道稱，單純應用DEN在12～15周能成功誘發大鼠肝硬化[12-13]，但此方法未見在小鼠中報道。因此，本實驗應用DEN對C57BL/6同系小鼠進行肝硬化誘發，得到了理想的小鼠肝硬化模型。

DEN具有較強的肝臟化學毒性，其所含的亞硝胺基團具有中毒劑和誘癌劑的雙重作用[14]，DEN誘發的腫瘤多為肝細胞癌，與人類肝細胞癌較為相似[15]。Sato等[16]研究表明，DEN是一種很強的化學致癌劑，且對肝臟有明顯的親和性。本實驗在用DEN誘導建模后，從形態學等方面進行了模型的驗證，經Masson三色染色證實實驗組小鼠肝組織中央靜脈及匯管區周圍膠原纖維隨時間變化明顯增生。在后期肝細胞索排列紊亂，肝細胞空泡樣變性，小葉間隔形成。

綜上所述，本實驗成功采用單劑量DEN短時期喂飼的方法建立同系小鼠肝硬化模型，具有死亡率低（小于10%）、操作方便、費用低廉、誘導周期短、重復性好、肝硬化率較高等特點，與人類肝硬化發病特點相似，拓展了小鼠肝硬化模型的構建方式，是一種成功的小鼠肝硬化模型。

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Oral DEN induction in establishment of liver cirrhosis in homologous mice

Tan Jiaxin，You Yu，Zeng Linli，Lai Jiejuan，Zhang Yujun，Bie Ping，Bai Lianhua
（Department of Hepatobiliary Surgery，Southwest Hospital of Third Millitary Medical University，Chongqing 400030，China）

ObjectiveTo attempt oral DEN to induce and establish hepatic cirrhosis model in C57BL/6 mice.MethodsA total of 60 C57BL/6 mice were randomly divided into the experimental group and the control group，30 of each group.The mice in the experimental group were fed with water contaning DEN while the control group with distilled water.The liver morphological structure and fibrillation of the two groups were observed by HE and Masson dyeing.The body weight variation of mice in the two groups was measured in consecutive 30 days.The difference in autokinetic movement between the two groups was investigated by behavioral approach to judge their mental state changes.ResultsIt showed with the longer DEN was given，the heavier the fibrosis tissue hyperplasia and hepatic cirrhosis degree displayed by HE and Masson dyeing.The semi-quantitative scoring system scoring at different time points in the experimental group had no statistical significance compared with that of the control group（P＜0.05）.The body weight declined obviously with increasing of feeding time in the experimental group while the mice in the control group slightly increased.There were statistical significance in difference（P＜0.05）.The behavioristics results showed that the total movement distance of the experimental mice was weaker than that of the normal mice，whose difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionDEN-induced hepatic cirrhosis model in C57BL/6 mice is successfully established from hepatic fibrosis，and it can be used as an ideal animal model for the study of human hepatic cirrhosis.

Diethylnitrosamine； Liver cirrhosis/pathology； Mouse； Model； Guide

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.005

：A

：1009-5519（2015）06-0812-03

2015-01-30）

國家自然科學基金資助項目（81170425）。

譚嘉鑫（1984-），男，重慶沙坪壩人，主要從事肝膽外科臨床工作；E-mail：330406265@qq.com。

白蓮花（E-mail：qqg63@outlook.com）。