冰凍切片技術(shù)在神經(jīng)病理診斷中的應(yīng)用

劉朝霞，徐 麗，王軍梅，杜 江，李桂林（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所，北京100050）

冰凍切片技術(shù)在神經(jīng)病理診斷中的應(yīng)用

劉朝霞，徐 麗，王軍梅，杜 江，李桂林
（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所，北京100050）

目的探討改進(jìn)術(shù)中冰凍切片質(zhì)量的技巧和方法，以利于提高冰凍切片的染色效果，提高冰凍切片病理診斷的準(zhǔn)確率。方法對(duì)2011年1月至2014年8月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的3 000例新鮮腦腫瘤標(biāo)本進(jìn)行取材、冰凍、切片、染色，制作冰凍切片。其中神經(jīng)上皮組織腫瘤2 103例，神經(jīng)腫瘤102例，腦膜腫瘤388例，淋巴造血系統(tǒng)腫瘤23例，生殖細(xì)胞腫瘤79例，鞍區(qū)腫瘤129例，轉(zhuǎn)移性腫瘤79例，其他腫瘤97例，對(duì)上述腫瘤的冰凍切片進(jìn)行回顧性分析，改進(jìn)染色方法，觀察染色效果，分析診斷準(zhǔn)確率。結(jié)果3 000例腦腫瘤標(biāo)本的冰凍切片染色效果良好，組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)清晰，一般制片過(guò)程約需10 min。術(shù)后與石蠟切片診斷對(duì)照，其中神經(jīng)上皮組織腫瘤2 078例，神經(jīng)腫瘤101例，腦膜腫瘤378例，淋巴造血系統(tǒng)腫瘤22例，生殖細(xì)胞腫瘤75例，鞍區(qū)腫瘤127例，轉(zhuǎn)移性腫瘤76例，其他腫瘤86例，診斷符合率為98.1%，未發(fā)現(xiàn)良、惡性質(zhì)相反的診斷。結(jié)論改進(jìn)冰凍切片的染色方法，可提高冰凍切片的染色質(zhì)量，提高病理診斷的準(zhǔn)確率。

冷凍超薄切片術(shù)； 染色與標(biāo)記； 神經(jīng)系統(tǒng)/病理學(xué)； 病理診斷

冰凍切片是利用低溫條件，使組織迅速凍結(jié)達(dá)到一定硬度并進(jìn)行切片的一種方法。術(shù)中冰凍診斷是病理科非常重要的一項(xiàng)工作，要求快速、準(zhǔn)確。冰凍切片質(zhì)量的好壞，直接影響病理診斷的速度和質(zhì)量。由于冰凍切片受到組織冷凍溫度、冷凍時(shí)間、組織含水量等因素的影響，在實(shí)際工作中會(huì)遇到一些問(wèn)題，如冰晶形成、切片皺褶、切片脫落、染色欠佳等。這就要求病理技術(shù)人員熟練掌握冰凍切片技術(shù)，并不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，以便快速切出精良的冰凍切片，為病理醫(yī)生診斷提供可靠保證。作者在實(shí)際工作中，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，對(duì)染色方法[1]進(jìn)行改進(jìn)，達(dá)到了滿意的染色效果，并對(duì)3 000例神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的冰凍切片診斷結(jié)果進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 對(duì)2011年1月至2014年8月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的新鮮腦腫瘤標(biāo)本3 000例進(jìn)行回顧性研究總結(jié)。3 000例腦腫瘤患者中男1 743例，女1 257例；年齡1～82歲，平均29.4歲；神經(jīng)上皮組織腫瘤2 103例，神經(jīng)腫瘤102例，腦膜腫瘤388例，淋巴造血系統(tǒng)腫瘤23例，生殖細(xì)胞腫瘤79例，鞍區(qū)腫瘤129例，轉(zhuǎn)移性腫瘤79例，其他腫瘤97例。所有腦腫瘤標(biāo)本均為術(shù)中新鮮切除，加入生理鹽水并立即送檢，制作冰凍切片。

1.1.2 設(shè)備與試劑 德國(guó)產(chǎn)LEICA CMl950型恒冷切片機(jī)、德國(guó)產(chǎn)LEICAHI1220烤片機(jī)、液氮、加拿大樹(shù)膠等；將Harris蘇木素染液、1%鹽酸乙醇溶液、水溶性伊紅染液、95%乙醇、80%乙醇、二甲苯盛于染色缸中備用。

1.2 方法

1.2.1 取材 將手術(shù)中送檢的組織按常規(guī)取材。腦腫瘤標(biāo)本多數(shù)較小，應(yīng)全取。較大的標(biāo)本應(yīng)選取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm組織塊。取材時(shí)應(yīng)避開(kāi)壞死出血區(qū)，剔除毛發(fā)、硬骨及鈣化點(diǎn)，盡量使標(biāo)本干燥。

1.2.2 冰凍 用滴管在冷凍托盤(pán)上滴加一滴自來(lái)水，將冷凍托盤(pán)置于液氮中，約10 s后取出，用自來(lái)水凝結(jié)成冰，將新鮮標(biāo)本放在冰面上，確定標(biāo)本與冰面黏結(jié)牢固后，將冷凍托盤(pán)再次置于液氮中，約10 s后取出，觀察新鮮標(biāo)本是否冷凍到合適硬度。可根據(jù)標(biāo)本大小及性質(zhì)調(diào)節(jié)冷凍時(shí)間。

1.2.3 切片 切片時(shí)手搖輪用力要均勻，轉(zhuǎn)速以8～ 10 r/min為宜。刀速緩慢均勻，厚度4～6 μm，根據(jù)切片大小，每切一片選擇預(yù)先放在冷凍箱內(nèi)合適的毛筆壓切片前緣使其不卷曲，展平后及時(shí)附貼于載玻片上。將載玻片放在烤片機(jī)上烘烤5s（烤片機(jī)溫度預(yù)設(shè)為56℃），然后置于95%乙醇中浸泡5 s進(jìn)行固定。

1.2.4 染色 將已固定的切片滴加Harris蘇木素染液，染液要覆蓋整個(gè)組織，置于烤片機(jī)上烘烤2 min，水洗，用1%鹽酸乙醇分化10 s，水洗返藍(lán)1 min，滴加水溶性伊紅染液10 s，水洗，95%乙醇浸泡30 s，80%乙醇浸泡30s，二甲苯浸泡30 s，加拿大樹(shù)膠封片。

2 結(jié) 果

2.1 染色效果 3 000例切片效果良好，切片完整，厚薄均勻、無(wú)皺折，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡粉色，細(xì)胞間質(zhì)及血管呈粉紅色，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核紅藍(lán)對(duì)比鮮明，細(xì)胞無(wú)腫脹及皺縮、空泡，無(wú)冰晶形成。組織結(jié)構(gòu)能較完整地呈現(xiàn)，分辨率良好，見(jiàn)圖1～4。一般制片過(guò)程約需10 min。

圖1 星形細(xì)胞瘤冰凍切片（HE染色，200×）

圖2 腦膜腫瘤冰凍切片（HE染色，200×）

圖3 神經(jīng)鞘瘤冰凍切片（HE染色，200×）

圖4 髓母細(xì)胞瘤冰凍切片（HE染色，200×）

2.2 診斷符合率 在3 000例冰凍切片中，有2 943例報(bào)告為明確診斷，并在石蠟切片診斷過(guò)程中得到證實(shí)，其中神經(jīng)上皮組織腫瘤2 078例，神經(jīng)腫瘤101例，腦膜腫瘤378例，淋巴造血系統(tǒng)腫瘤22例，生殖細(xì)胞腫瘤75例，鞍區(qū)腫瘤127例，轉(zhuǎn)移性腫瘤76例，其他腫瘤86例，術(shù)后診斷符合率為98.1%。有57例未作出明確診斷，以鏡下所見(jiàn)形態(tài)進(jìn)行描述的方法報(bào)告。在冰凍切片診斷與石蠟切片診斷對(duì)照的過(guò)程中，未發(fā)現(xiàn)良、惡性質(zhì)相反的診斷。3 000例腦腫瘤冰凍切片與石蠟切片診斷符合情況見(jiàn)表1。

表1 3 000例腦腫瘤冰凍切片與石蠟切片診斷符合情況

3 討 論

冰凍切片病理診斷是手術(shù)過(guò)程中確定疾病性質(zhì)、指導(dǎo)臨床醫(yī)生在手術(shù)過(guò)程中決定手術(shù)方案的一種快速而可靠的手段[2]。1818年Fleter de ffiemer首創(chuàng)冰凍切片技術(shù)，1891年Halsted和Aceop將冰凍切片技術(shù)列為正式診斷方法。其原理是利用低溫冷凍技術(shù)使待檢組織變硬，以代替石蠟包埋，進(jìn)行組織制片的一種方法[3]。制片的好與壞，直接影響著臨床病理診斷效果。

正確取材在術(shù)中冰凍切片診斷中至關(guān)重要。組織塊適宜大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，組織塊過(guò)大，易影響制片質(zhì)量，造成切片皺折、形成刀痕等。腦腫瘤多數(shù)送檢標(biāo)本較小，應(yīng)全取，并剔除毛發(fā)、硬骨及鈣化。在取材時(shí)盡量使標(biāo)本干燥，若標(biāo)本混有水分，切片時(shí)由于冰和標(biāo)本的硬度不同，易致切片皺折，無(wú)法展開(kāi)，導(dǎo)致切片困難。

冷凍溫度和時(shí)間是冰凍切片制作過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，直接影響冰凍切片的質(zhì)量。一般恒溫冰凍切片機(jī)的工作室溫度控制在-24～-20℃，不同組織的冷凍溫度和時(shí)間要求不同，時(shí)間為數(shù)分鐘不等[4-6]。本研究采用液氮冷凍的方法，可使組織迅速冷凍，縮短冷凍時(shí)間，更有效地防止冰晶形成。本研究3 000例腦腫瘤冰凍切片中無(wú)一例出現(xiàn)冰晶。多數(shù)實(shí)驗(yàn)包埋時(shí)選用進(jìn)口包埋劑最佳切削溫度的化合物（OCT）或普通膠水[7-8]，本研究采用直接將標(biāo)本置于冰面上的方法，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本，減少實(shí)驗(yàn)步驟，縮短制片時(shí)間。在冷凍托盤(pán)上制作冰面時(shí)，冷凍時(shí)間要適宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致冰面過(guò)分干燥，時(shí)間過(guò)短易致冰面水分剩余過(guò)多，二者均可造成標(biāo)本黏固不牢，滑落液氮中。將新鮮標(biāo)本放在冰面上，必須確定標(biāo)本與冰面黏結(jié)牢固后，再置于液氮中，這樣可有效防止標(biāo)本滑落液氮中。若標(biāo)本較大或質(zhì)地較韌，與冰面黏固不牢，可在標(biāo)本底部加一滴水進(jìn)行冷凍。標(biāo)本冷凍時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使組織過(guò)硬，切片時(shí)易呈碎屑，可在切出完整平面后用戴手套的拇指按壓或在組織切面上哈氣回溫，使組織變軟后再切。標(biāo)本為數(shù)塊碎組織時(shí)，應(yīng)盡量將標(biāo)本置于同一平面，以利于切片完整。

切片時(shí)適宜厚度為4～6 μm，可根據(jù)切片大小，每切一片選擇預(yù)先放在冷凍箱內(nèi)合適的毛筆壓切片前緣使其不卷曲，展平后及時(shí)附貼于載玻片上。切片時(shí)注意事項(xiàng)：切片時(shí)應(yīng)充分暴露組織最大切面，帶有包膜的組織須切出包膜，以便觀察腫物是否浸潤(rùn)。但切片時(shí)也必須注意觀察重點(diǎn)病變的微小病灶，避免修切過(guò)度，造成漏診[9]。載玻片可選用經(jīng)防脫APES處理后的載玻片。若無(wú)防脫膠玻片，可用普通載玻片進(jìn)行黏附，然后將載玻片放入恒溫干燥箱內(nèi)底板上，此時(shí)要使黏有組織的一面朝上，烤片10 s后拿出在室溫中稍加冷卻后放入AAF固定液中進(jìn)行固定及染色，此時(shí)組織便可牢牢地黏在載玻片上[10]。也有學(xué)者將載玻片用1%鹽酸溶液浸泡0.5 h，撈出用清水沖洗干凈再用95%乙醇浸泡10 min，蒸餾水洗凈，烤干后備用[11]。在選擇固定液時(shí)，有研究表明，在10%甲醛、95%乙醇、AAF固定液、丙酮、甲醇和乙醚乙醇（乙醚∶乙醇1∶1）6種固定液中，乙醚乙醇（乙醚∶乙醇1∶1）固定液較其他5種固定液的制片效果更好[12]。通常使用普通載玻片，將組織黏附在載玻片后，放在烤片機(jī)上烘烤5 s，然后置于95%乙醇中浸泡5 s進(jìn)行固定，防脫片效果良好，未發(fā)生過(guò)脫片現(xiàn)象。

染色過(guò)程中需掌握好每一步所需時(shí)間，并盡量振動(dòng)切片，使組織與固定液、染色液、脫水液充分融合，加快染色速度，提高染色質(zhì)量。在染色時(shí)用烤片機(jī)加熱切片，以加快染色速度，并且染色步驟較少，也縮短了染色時(shí)間，整個(gè)制片過(guò)程約需10 min。

本研究結(jié)果顯示，3 000例冰凍切片染色效果良好，切片完整，厚薄均勻、無(wú)皺折，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)清晰。術(shù)后診斷符合率為98.1%。未發(fā)現(xiàn)良、惡性質(zhì)相反的診斷。

總之，制作冰凍切片是一項(xiàng)重要的病理實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在取材、冰凍、切片及染色的每一個(gè)環(huán)節(jié)中都必須充分掌握其技術(shù)要領(lǐng)，控制好各個(gè)操作環(huán)節(jié)，并且要求操作人員具有一絲不茍的工作態(tài)度和責(zé)任心，才能制作出優(yōu)質(zhì)的冰凍切片。

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讀者·作者·編者

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在文后志謝是表示感謝并記錄在案的意思。對(duì)給予實(shí)質(zhì)性幫助而又不能列為作者的單位或個(gè)人應(yīng)在文后給予志謝。但必須征得被志謝人的書(shū)面同意。志謝應(yīng)避免以下傾向：（1）確實(shí)得到某些單位或個(gè)人的幫助，甚至用了他人的方法、思路、資料，但為了搶先發(fā)表，而不公開(kāi)志謝和說(shuō)明；（2）出于某種考慮，將應(yīng)被志謝人放在作者的位置上，混淆了作者和被志謝者的權(quán)利和義務(wù)；（3）以名人、知名專(zhuān)家包裝自己的論文，抬高論文的身份，將未曾參與工作的，也未閱讀過(guò)該論文的知名專(zhuān)家寫(xiě)在志謝中。被志謝者包括：（1）對(duì)研究提供資助的單位和個(gè)人、合作單位；（2）協(xié)助完成研究工作和提供便利條件的組織和個(gè)人；（3）協(xié)助診斷和提出重要建議的人；（4）給予轉(zhuǎn)載和引用權(quán)的資料、圖片、文獻(xiàn)、研究思想和設(shè)想的所有者；（5）作出貢獻(xiàn)又不能成為作者的人，如提供技術(shù)幫助和給予財(cái)力、物力支持的人，此時(shí)應(yīng)闡明其支援的性質(zhì)；（6）其他需志謝者。

本刊編輯部

The application of frozen sections technique in diagnosis of neuropathology

Liu Zhaoxia，Xu Li，Wang Junmei，Du Jiang，Li Guilin
（Beijing institute of neurosurgery of Capital Medicial University，Beijing 100050，China）

ObjectiveTo explore and improve the skills and methods of the quality of frozen sections in order to improve the staining effect of frozen sections and raise the rate of correct diagnosis.MethodsA total of 3 000 cases of fresh brain tumors specimens underwent neurosurgical operations in Beijing Tian Tan Hospitalof Capital Medical University from January 2011 to August 2014 were drawn，frozen，sliced and stained successively，including 2 103 with neuroepithelial tumors，102 with nervous tumors，388 with meningeal tumors，23 with lymphohematopoietic tumors，79 with germ cell tumors，129 with sellar tumors，79 with metastatic tumors and 97 with other tumors.A retrospective analysis of the aboved frozen sections was made to improve the staining assay，observe the staining effect and analyze the accuracy rate of diagnosis.ResultsThe frozen sections of all the brain tumors samples in this study were perfectly stained with intact organizational structures and clear cell morphologies.Dyeing process takes about ten minutes.With a comparison of the diagnosis of paraffin sections after the surgery，it showed 2 078 with neuroepithelial tumors，101 with nervous tumors，378 with meningeal tumors，22 with lymphohematopoietic tumors，75 with germ cell tumors，127 with sellar tumors，76 with metastatic tumors and 86 with other tumors.accounting for 98.1%in diagosis accuracy. There were no contrary diagnosis involving in benign and malignant neoplasias.ConclusionImproving the staining assay of frozen sections may improve the staining quality of frozen sections and the rate of correct diagnosis.

Cryoultramicrotomy； Staining and labeling； Nervous system/pathology； Pathology diagnosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.006

：A

：1009-5519（2015）06-0815-03

2014-11-06）

劉朝霞（1969-），女，北京東城人，主管技師，主要從事腦腫瘤的病理學(xué)及分子病理學(xué)研究；E-mail：liuzhaoxia69@sina.com。

李桂林（E-mail：liguilin2010@sina.com）。