氯化鎳對真核小鼠胚胎成纖維細胞超氧化物歧化酶2的影響及其機制

王盼盼，常文輝，駱文靜，陳景元，杜可軍（.第四軍醫大學勞動與環境衛生教研室，陜西西安7002；2.第四軍醫大學口腔醫學系，陜西西安7002；.陜西省疾病預防控制中心，西安70054）

氯化鎳對真核小鼠胚胎成纖維細胞超氧化物歧化酶2的影響及其機制

王盼盼1，2，常文輝3，駱文靜1，陳景元1，杜可軍1
（1.第四軍醫大學勞動與環境衛生教研室，陜西西安710032；2.第四軍醫大學口腔醫學系，陜西西安710032；3.陜西省疾病預防控制中心，西安710054）

目的在真核小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）內，進行不同濃度或不同時間的氯化鎳（NiCl2）刺激，觀察超氧化物歧化酶2（SOD2）的變化，對其可能機制進行探討。方法培養MEF系，制備NiCl2溶液進行處理，利用Western blotting觀察不同濃度或不同時間的NiCl2刺激后SOD2的變化。隨后判斷其可能的機制。結果不同濃度的NiCl2刺激MEF 12 h后，SOD2的表達總體上有下降趨勢，磷酸化蛋白激酶B的表達總體上有上升趨勢，而磷酸化信號轉導和轉錄激活子（p-Stat3）的表達總體上有下降趨勢；相同濃度的NiCl2刺激MEF不同時間后，SOD2和p-Stat3的表達總體上有下降趨勢；p-Stat3與SOD2的總體變化趨勢一致。結論SOD2在受到NiCl2的刺激作用后，總體上呈現下降趨勢；p-Stat3可能是作為轉錄因子，在轉錄水平上進行了SOD2的調控。

鎳； 超氧化物歧化酶； 成纖維細胞； 基因表達； 氯化鎳

鎳作為一種重要的有色金屬，廣泛存在于多種合金中，被稱為“工業維生素”。鎳是不銹鋼主要合金原料[1]。全球不銹鋼產量的迅速增加，直接刺激了鎳需求的急速上升。進入21世紀，中國不銹鋼的產量達到世界首位，牽動全球不銹鋼總產量的走勢。目前，國內直接接觸鎳及其化合物的作業人員數量很多[2]。對環境而言，鎳是一種潛在的危害物。環境中鎳污染的最大來源是人為活動，包括鎳礦及其他重金屬礦的開采、冶煉、粉末冶金及相關企業的“三廢（廢水、廢氣和廢渣）”，化學試劑及其他含鎳制品的生產和使用等。鎳毒性給人類的健康帶來了極大痛苦和損失，國際癌癥研究中心已經將鎳化合物定義為人類致癌物，所以加大對鎳及其相關毒性的防治研究具有重要現實意義。本研究在真核小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）內進行不同濃度或不同時間的氯化鎳（NiCl2）刺激，觀察超氧化物歧化酶2（SOD2）的變化，對其可能機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 特異性抗體[磷酸化信號轉導和轉錄激活子（p-Stat3，Tyr-705）、p-Stat3（Ser-727）、Stat3、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，Thr-308）、p-Akt（Ser-473）、Akt]購置于美國Cell Signaling，Beverly，MA公司。特異性抗體SOD2購置于美國Epitomics，Burlingame，CA公司。特異性抗體肌動蛋白β（β-actin）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購置于美國Sigma，St.Louis，MO公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MEF的培養主要采用方法參照文獻[3]。具體如下：培養采用DMEM培養液加10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺（CA），37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下孵箱培養。待生長至對數生長期時進行傳代。

1.2.2 細胞處理 制備NiCl2溶液，在6孔板中采用2 mmol/L的終濃度 NiCl2分別對 MEF進行 0、3、6、9、12、24 h處理；同時采用0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L終濃度NiCl2分別對MEF進行12 h處理。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western blotting）處理

1.2.3.1 細胞放置在6孔培養板里進行培養，生長密度達到培養孔面積的85%時收集細胞。收集細胞時培養板置于冰上。細胞首先用4℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，然后用裂解液進行處理。裂解液的組成包括10mmol/LTris-HCl、pH=7.4的 1%十二烷基硫酸鈉、1 mmol/L Na3VO4及蛋白酶抑制劑，細胞蛋白的提取物參照文獻[2]的方法進行處理，先用超聲波進行處理，接下來置于100℃下5min進行蛋白變性，用于蛋白電泳。

1.2.3.2 Western blotting檢測[4]。裂解后的細胞進行蛋白定量檢測。蛋白定量檢測試劑盒購置于美國Bio-Rad Lab oratories，Hercules，CA公司。對等量的細胞裂解蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE）。接下來蛋白被轉移到聚偏二氟乙烯膜上，PVDF膜來源于美國Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA公司。轉膜之后封閉，接下來分別加入一抗，進行p-Stat3（Tyr-705）、p-Stat3（Ser-727）、Stat3、p-Akt（Thr-308）、p-Akt（Ser-473）、Akt、SOD2、β-actin、GAPDH等檢測；采用堿性磷酸酶標記的二抗，使用增強化學發光法進行Western blotting檢測。

2 結 果

2.1 不同濃度NiCl2作用于MEF 12 h后SOD2及p-Akt表達變化 不同濃度的NiCl2（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）作用于MEF 12 h后，可觀察到SOD2蛋白的表達總體上有下降趨勢。同樣的NiCl2作用條件下，可以觀察到p-Akt蛋白表達無論是在Ser-473位點，還是在Thr-308位點，總體上都有增高趨勢。與此同時，可以觀察到在不同濃度的NiCl2作用于MEF 12 h后，總Akt蛋白表達量總體上無明顯變化。見圖1。

圖1 不同濃度NiCl2作用于MEF12h后SOD2及p-Akt表達變化

2.2 不同濃度NiCl2作用于MEF 12 h后p-Stat3表達變化 不同濃度的NiCl2（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）作用于MEF細胞12 h后，可以觀察到p-Stat3蛋白的表達總體上有下降趨勢。可以觀察到p-Stat3蛋白表達無論是在Ser-727位點，還是在Tyr-705位點，總體上都有降低趨勢。與此同時，可以觀察到在不同濃度的NiCl2作用于MEF細胞12 h后，Stat3蛋白的表達量總體上無明顯變化。見圖2。

圖2 不同濃度NiCl2作用于MEF 12 h后p-Stat3表達變化

2.3 相同濃度NiCl2作用于MEF不同時間SOD2及p-Stat3表達變化 相同濃度的Nicl2（2 mmol/L）作用于MEF 0、3、6、9、12、24 h后，可以觀察到SOD2及p-Stat3蛋白的表達總體上有下降趨勢，而且可以觀察到p-Stat3蛋白表達無論是在Ser-727位點，還是在Tyr-705位點，總體上都有降低趨勢。與此同時，可以觀察到在相同濃度的NiCl2作用于MEF不同時間后，Stat3蛋白的表達量總體上無明顯變化。見圖3。

圖3 相同濃度NiCl2作用于MEF不同時間p-Stat3表達變化

3 討 論

作為一種重要的有色金屬，鎳及其化合物在工業生產中有廣泛應用。但同時鎳化合物又被確定為人類致癌物。對鎳化合物中毒機制的研究，有利于工業生產開展針對性的職業安全防護。研究表明，鎳化合物可以誘導體內產生氧化應激反應，通過產生超氧陰離子自由基損傷細胞，導致機體產生明顯的氧化損傷，繼而導致機體出現各種損傷，甚至引起細胞發生突變、腫瘤發生等[1]。

機體有一套完整的抗氧化體系，能防止自由基帶來的氧化損傷，其中SOD[5]是以超氧陰離子自由基為底物的金屬蛋白酶，其可將自由基催化為過氧化物，再在谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶的催化下成為水。SOD作為體內最主要的抗氧化物酶，保護細胞免受損傷，其活力可間接反映機體抗氧化損傷和清除自由基的能力。迄今為止，已發現SOD有3種[6]，包括SOD1，又名Cu-Zn SOD，主要存在于真核生物細胞質中；SOD2，又名Mn-SOD，在真核生物及原核生物的線粒體中普遍存在；SOD3，又名Fe-SOD，主要存在于原核生物中。

越來越多的證據表明，SOD2可能作為一種新的腫瘤抑制劑而發揮作用[7]。研究表明，SOD2的活性在超過80種的腫瘤細胞中有所下降[8]。過表達的SOD2將會導致部分腫瘤細胞的抑制[8]，SOD2可能與部分腫瘤受到抑制有關[9]。因此，研究SOD2的分子調控機制在腫瘤學及相關研究領域具有非常重要的意義。本研究結果表明，不同濃度NiCl2作用相同時間或相同濃度NiCl2作用不同時間，都能導致SOD2有一定程度下降。本研究結果也表明，導致SOD2下降的同時，可以引起p-Akt表達量的增高。提示p-Akt可能與SOD2的負調控有關。這些與Du等[10]研究結果是一致的。

Akt又稱蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt在細胞的存活和凋亡中起重要作用。多種因子包括胰島素等生長和存活因子都能激活Akt信號途徑。有研究表明，Akt分子通過對FoxO3a等分子的調控，主要是調節Ser-253和Ser-315等位點的磷酸化[11]。Ser-253等位點的磷酸化FoxO3a導致蛋白核定位的改變，最終導致其與調控基因的啟動子進行結合，從而實現了對目的基因的調控[12]。

研究表明，鎳對SOD的下調可能在蛋白或基因水平都有體現[1]，提示這種調控作用有可能發生在轉錄水平。許多轉錄因子包括特異性蛋白1（SP1）、激活蛋白1（AP1）、Stats等分子，都在一定程度上參與了SOD2分子的調控[13-14]。本研究結果證明，不同濃度的NiCl2作用于MEF 12 h后或相同濃度的NiCl2作用于MEF不同時間后，SP1、AP1的變化趨勢同SOD2的變化并不一致（圖片未附），提示在現有作用條件下，SP1和AP1可能并未參與對SOD2在轉錄水平的調控。而p-Stat3蛋白，無論是在Ser-727位點，還是在Tyr-705位點，表達量總體上都有降低趨勢。這些變化趨勢，都同SOD2的總體變化趨勢基本一致。提示p-Stat3有可能作為轉錄因子在NiCl2誘導SOD2表達下降的過程中發揮作用。

綜上所述，本研究結果表明，在NiCl2作用于MEF后，能夠引起MEF內的SOD2表達水平下降，這種下降可能是受到Akt的負調控，并且可能發生在轉錄水平，Stat3有可能作為一種轉錄因子在其中起到一種調控作用。本研究發現了NiCl2對SOD2的調控可能是通過p-Stat3進行調控，并且這種調控可能發生在轉錄水平。本研究為SOD2的進一步探索打下了基礎，但更為直接的證據呈現尚有待于進行Stat3與SOD2的免疫共沉淀等研究。

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Effect with NiCl2 on SOD2 in MEF eukaryotic cells and its mechanisms

Wang Panpan1，2，Chang Wenhui3，Luo Wenjing1，Chen Jingyuan1，Du Kejun1
（1.Department of Occupational and Environmental Health，Fourth Military Medical University，Xi′an，Shaanxi 710032，China；2.Department of Oral Medicine，Fourth Military Medical University，Xi′an，Shaanxi 710032，China；3.Shaanxi Center for Disease Control and Prevention，Xi′an 710054，China）

ObjectiveIn MEF eukaryotic cells，it was stimulated with NiCl2with different concentrations and times.It is investigated the change of SOD2 and its potential mechanisms.MethodsCultivating MEF cells line and preparing Nicl2 solutions，it was observed the change of SOD2 stimulated by NiCl2of different concentrations and times by Western blotting and then judged the potential mechanism.ResultsAfter stimulating MEF for continuous 12 hours with different-concentration NiCl2，the expression of SOD2 was orientated to declining and p-Stat3 and p-Akt rising respectively in general.After stimulating MEF for different time period with the same-concentration NiCl2，the expressions of SOD2 and p-Stat3 were both orientated to decline and rising respectively generally.The overall change of SOD2 and p-Stat3 were in consistent.ConclusionStimulated by NiCl2，SOD2 showed a trend of decline，p-Stat3，probably as the transcription factor，adjusted SOD2 on the transcriptional level.

Nickel； Superoxide dismutase； Fibroblasts； Gene expression； Nickel chloride

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.008

：A

：1009-5519（2015）06-0820-03

2014-10-12）

國家自然科學基金資助項目（30972429）；教育部長江學者創新團隊計劃項目（PCSIRT1112）；中國博士后課題資助項目（20060391015）。

王盼盼（1992-）,男，陜西西安人，主要從事環境分子毒理學研究；E-mail：cd_novo@hotmail.com。

杜可軍（E-mail：dukejun@fmmu.edu.cn）。