吡格列酮抑制體外高糖培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞炎癥作用的研究

胡 梅，鮑翠玉，駱曉艷

(湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨(dú)立于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓性心臟病、心臟瓣膜病及其它心臟病的特異性心肌疾病，它是糖尿病患者常見的心血管并發(fā)癥之一，與糖尿病患者心力衰竭發(fā)生率和死亡率密切相關(guān)。現(xiàn)已引起臨床醫(yī)生和流行病學(xué)專家高度的重視。目前關(guān)于DCM 各方面的報(bào)道很多，其確切發(fā)病機(jī)制不是很清楚，也沒統(tǒng)一的治療方案。高糖血癥是引起DCM 的主要病因，研究表明［1，2］，炎癥反應(yīng)在DCM 的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用。吡格列酮(pioglitazone，PGZ)是臨床上常用的一種新型降糖藥，研究證明［3］，它不僅能降低血糖而且對組織器官有抗氧化、抗炎等保護(hù)作用。目前關(guān)于PGZ 對糖尿病心肌的抗炎作用尚少見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞，觀察PGZ 對高糖培養(yǎng)下的心肌細(xì)胞的炎癥因子影響，探討PGZ 對DCM 的保護(hù)作用可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康SD 新生大鼠，出生0～3d，雌雄不拘。由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(NO.42000500004462)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 PGZ 原粉劑(中國食品藥品檢定研究院)，DMEM 粉狀培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，炎癥因子檢測ELISA 試劑盒(欣博盛公司)，細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天生物)，單克隆p38 抗體，單克隆磷酸化p38 抗體，單克隆p65 抗體均購自Cell Signaling Technology。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取出生0～3d 的乳鼠若干只，用75%的酒精消毒表面皮膚，隨后迅速取出心臟并置于4℃預(yù)冷的D-Hank’s 液中洗凈污血，用眼科剪減去心臟周圍的大血管和組織，將心臟剪碎大約1～2mm2大小，用胰酶與Ⅱ型膠原酶混合消化10min，收集上清液，常溫下1000rpm，10min 離心，去掉上清，收集離心管下面的沉淀即所得細(xì)胞，采用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞。最后將細(xì)胞接種于含有20% 的胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中，并置于CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將分離的乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h 首度換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長勢，待其細(xì)胞長至90%融合時(shí)，將細(xì)胞分成以下幾組并同時(shí)給藥處理，正常對照組:5.5mmol/L 的葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基加25mmol/L的甘露醇;高糖模型組:30mmol/L 的葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基;低劑量組:30mmol/L 的葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基加入終濃度為10μmol/L 的PGZ;高劑量組:30mmol/L 的葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基加入終濃度為20μmol/L 的PGZ;以上各組細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)48h 后進(jìn)行以下指標(biāo)測定。

1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH)含量的測定 取培養(yǎng)后心肌細(xì)胞的上清液，用LDH 試劑盒檢測，嚴(yán)格按照說明書操作，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 的含量作為判斷心肌細(xì)胞受損程度指標(biāo)。

1.2.4 炎癥因子IL-6 和TNF-α 含量的測定 取培養(yǎng)后心肌細(xì)胞的上清液，用ELISA 試劑盒檢測，該指標(biāo)用來判斷高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞內(nèi)的炎癥因子水平的變化。

1.2.5 乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活性檢測 分析NF-κB 的活性采用Western blot 檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)量，H3 作為核內(nèi)參，核蛋白的提取嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.2.6 乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)P38MAPK 的蛋白水平測定 采用Western blot 方法分別檢測磷酸化蛋白(P-P38)與P38MAPK 蛋白的表達(dá)量，并用P-P38/P38 作為判斷P38MAPK 的激活狀況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P ＜0.05 為差異有顯著性，P ＜0.01 為差異有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 的含量 在高糖環(huán)境下，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、IL-6 和TNF-α 的含量顯著上升，而給予PGZ 處理后，能明顯的抑制LD、IL-6 和TNF-α 的改變，各組間比較有顯著性差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 高糖刺激和PGZ 處理對乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LD、IL-6 和TNF-α 含量的影響

2.2 NF-κB 活性的檢測結(jié)果 細(xì)胞在高糖的誘導(dǎo)下，心肌細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組，且差異有顯著性意義，經(jīng)PGZ處理后，能有效的抑制高糖對p65 蛋白表達(dá)量改變。見圖1。

圖1 高糖刺激和PGZ 處理對乳鼠心肌細(xì)胞胞核NF-κB p65 蛋白表達(dá)量的影響

2.3 乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)P38MAPK 蛋白表達(dá)量的結(jié)果 高糖組P-P38 相對蛋白量與正常組比較呈明顯上升趨勢，且兩組間差異成顯著性，經(jīng)藥物處理后，上述上升的趨勢得到有效的逆轉(zhuǎn)。見圖2。

圖2 高糖刺激和PGZ 處理對乳鼠心肌細(xì)胞p38 蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

多種機(jī)制共同參與了DCM 的病理生理過程，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間質(zhì)纖維化及左心室肥厚，其中炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激起著最上游的級聯(lián)調(diào)控作用［4］。廣泛研究證明了在糖尿病心肌組織中可見大量炎癥因子水平上升，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，乳鼠心肌細(xì)胞在高糖的誘導(dǎo)下，培養(yǎng)液中炎癥因子IL-6 和TNF-α 的含量明顯高于其它組，與此同時(shí)，高糖組培養(yǎng)液中LDH 的活性也增加，說明心肌細(xì)胞受損引起LDH 外漏，以上表明高糖能誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥性損傷。

NF-κB 是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，P50/P65 是其常見的異源二聚體，NF-κB 激活后與抑制蛋白(IKB)解離，從胞漿移至胞核并與其特異的啟動(dòng)子結(jié)合來調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)。研究報(bào)道［5］它能調(diào)控炎癥因子:IL-1、IL-6、TNF-α、VCAM-1 等的基因表達(dá)。心肌細(xì)胞表達(dá)促炎因子受體、IL-1、TNFα 及IKK(核因子抑制物激酶)復(fù)合體均需要NFκB 信號的活化。體內(nèi)外研究表明［6］，在糖尿病心肌損傷中可見NF-κB 的活化程度明顯的上升。本次實(shí)驗(yàn)我們也發(fā)現(xiàn)，與正常組對比高糖組心肌細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)量顯著升高，說明在高糖誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄因子被激活后發(fā)生了核移位，在核內(nèi)進(jìn)一步調(diào)控炎癥因子的基因表達(dá)，致使培養(yǎng)液中炎癥因子 IL-1、TNF-α的水平上升。P38MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)參與了多種信號通路的調(diào)控，Ulivi 等［7］的研究結(jié)果顯示，在軟骨細(xì)胞中P38MAPK 的激活可促進(jìn)NF-κB 的活化，當(dāng)給予P38MAPK 特異性抑制劑SB203580 后P38MAPK 和NF-κB 的活化都受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)［8］p38MAPK 信號通路的激活進(jìn)能促進(jìn)IκBɑ(核因子NF-κB 抑制蛋白)磷酸化和降解，從而直接激活NF-κB 通路。而在糖尿病心肌病中對此通路研究甚少，本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)高糖組心肌細(xì)胞的P-P38/P38 比值明顯升高，說明該組P38MAPK 通路已明顯激活，因此有可能在糖尿病心肌病中通過P38MAPK/NF-κB 這條信號通路來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中炎癥反應(yīng)。

PGZ 是噻唑烷二酮類降糖藥，屬胰島素增敏劑，作用機(jī)制與胰島素的存在有關(guān)，可減少外周組織和肝臟的胰島素抵抗，增加依賴胰島素的葡萄糖的處理，并減少肝糖的輸出。PGZ 除了有降血糖作用外對組織器官還有它保作用，特別是對心肌組織。研究發(fā)現(xiàn)，PGZ 能改善心肌左室肥大、心肌纖維化、心室舒張期功能障礙和氧化應(yīng)激。最近有發(fā)現(xiàn)PGZ 有抗炎癥作用。劉亭亭［9］等用PGZ 處理炎癥性腸病小鼠后，發(fā)現(xiàn)與對照組相比小鼠血清中炎癥因子TNF-α、C-反應(yīng)蛋白的水平明顯下降。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)PGZ 處理后培養(yǎng)液中 LDH 的活性、炎癥因子的含量、P38MAPK 蛋白表達(dá)量以及NF-κB 的活化程度都得到有效的逆轉(zhuǎn)，說明PGZ 能保護(hù)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞的損傷，其保護(hù)作用機(jī)制可能抑制P38/NF-κB 通路的激活來減少炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，低劑量與高劑量組間沒差異，說明PGZ 對心肌細(xì)胞的保護(hù)成一定的劑量依賴性。

綜上所述，高糖可促進(jìn)心肌細(xì)胞的炎癥因子的產(chǎn)生增多，并對心肌細(xì)胞形成炎癥性損傷，PGZ處理細(xì)胞后，對高糖下的心肌細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與p38MAPK/NF-κB 此條信號通路有關(guān)。心肌細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)能引起多種病理變化，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生，嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，如果能夠抑制心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對心肌細(xì)胞是一種非常有效的保護(hù)方法，將成為臨床上治療DCM新的策略。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PGZ對高糖誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有一定的保護(hù)作用，這將為臨床上開發(fā)新一代防治糖尿病心肌病的藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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