心肌缺血再灌注損傷中TNF-α血清水平表達(dá)對心肌收縮功能影響的實驗研究

鄭俊華，唐浩然，景麗英，羅瓊珍

心肌缺血再灌注損傷中TNF-α血清水平表達(dá)對心肌收縮功能影響的實驗研究

鄭俊華，唐浩然，景麗英，羅瓊珍

目的 探討心肌缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子α(TNF-α)血清水平表達(dá)對心肌收縮功能的影響。方法 用健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠制作心肌缺血再灌注損傷模型。連接BioLab-410型生物信號采集和處理系統(tǒng)，記錄心電圖，測定并記錄心肌缺血前、缺血30 min及再灌注30 min、60 min、90 min、120 min各個時相點血清中TNF-α水平和平均動脈壓(MAP)、心肌收縮功能，分析TNF-α水平與心肌收縮功能相關(guān)性。結(jié)果 冠狀動脈結(jié)扎后30 min，大鼠血清中TNF-α較缺血前明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，再灌注后較缺血前、缺血30 min顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，再灌注后維持在較高水平。冠狀動脈結(jié)扎30 min后，MAP、心率(HR)、左室收縮末壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)明顯降低，左室舒張末壓(LVEDP)明顯增高，與缺血前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與缺血前、缺血30 min比較，再灌注后MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低，LEVDP顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 心肌缺血再灌注損傷中血清TNF-α水平的表達(dá)與心肌收縮功能出現(xiàn)平行的同向變化趨勢，具有明顯的相關(guān)性，TNF-α血清水平升高會抑制心肌收縮功能。

心肌缺血；再灌注損傷；腫瘤壞死因子；心肌收縮功能

心臟缺血性疾病的發(fā)病率和致死率在世界范圍內(nèi)呈增長趨勢[1]，嚴(yán)重危害人類健康。心肌持續(xù)性缺血可導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡。心肌缺血最有效的治療措施是恢復(fù)血液供應(yīng)，缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)的過程稱為再灌注，盡管早期再灌注對組織非常重要，但再灌注可使缺血心肌損傷加重，即產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷(ischermic reperfusion injury，IRI)[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮了重要作用[4]。近年來，腫瘤壞死因子與缺血再灌注損傷的關(guān)系以及抗腫瘤壞死因子治療日益受到重視。研究結(jié)果顯示，有效降低TNF-α水平，可增加射血分?jǐn)?shù)，減少缺血再灌注心臟發(fā)生新功能不全延緩心室重塑、減少心肌細(xì)胞凋亡及降低死亡率[5]。本實驗采用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察血清中TNF-α表達(dá)水平對心肌收縮功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔(clean，CL)級健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠57只，年齡12周，體重250 g～300 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證：SCXK(粵)2006-0015。

1.2 儀器 TKB-200C型小動物呼吸機(江蘇省特力麻醉呼吸設(shè)備公司)；DT-8836紅外線體溫加熱器(深圳市杰能寶智能科技有限公司)；BioLab-410型生物信號采集和處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；U型水銀壓力計(自制)；電子天平。

1.3 藥品與試劑 3%戊巴比妥鈉；TNF-α ELLSA檢測試劑盒(上海依科賽有限公司)。

1.4大鼠活體心肌缺血再灌注損傷模型建立

1.4.1 參照文獻(xiàn)[6]的方法改良進(jìn)行建模 大鼠均用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，為控制呼吸道分泌物，術(shù)前給予阿托品。連接生物機能實驗系統(tǒng)，記錄心電圖。待SD大鼠麻醉后，常規(guī)去毛，消毒皮膚，剪皮，鈍性分離并暴露氣管，切開立即用24G×0.75、0.7mm×1.9mm規(guī)格的靜：脈留置針前軟管(1.5 mm×2.0 mm)行氣管插管，連接小動物呼吸機輔助呼吸，調(diào)節(jié)潮氣量維持在1 mL/100 g～1.5 mL/100 g，呼吸次數(shù)80次/min～100次/min，I∶E=1∶2，壓力在5 cmH2O～15 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)之間，根據(jù)呼吸頻率及強度調(diào)整呼吸參數(shù)。采用紅外線體溫加熱器維持體溫在36.5 ℃～37.0 ℃。開胸手術(shù)：大鼠采用右側(cè)臥位，暴露左側(cè)腋窩，從左腋窩下緣做橫行切口至左胸骨旁剪開皮膚，距離胸骨中線約2 mm，整個橫行切口大約8 mm。逐層分離，剪斷胸大小肌，暴露胸壁肋間隙，在第3～5肋間隙鈍性分離肋間肌，進(jìn)入胸腔。采用自制拉鉤，以四角撐開肋間隙暴露范圍6 mm～8 mm，剝離心包膜充分顯露左心耳及左心室。在左心耳與肺動脈圓錐之間，找到于心肌內(nèi)與心大靜脈走向一致的冠狀動脈左前降支，在左心耳根部1 mm～2 mm處，以3/8號帶線縫合針穿線結(jié)扎左冠狀動脈，結(jié)

扎線下置雙股2號線作松解用。阻斷左冠狀動脈30 min，再灌注，造成心肌缺血再灌注損傷模型。動物模型成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎左冠狀動脈前降支，肉眼觀心臟左室壁出現(xiàn)變暗變紫，心電圖顯示ST段弓背向上抬高(>0.25 mV)，QRS波增寬；30 min后，松開活結(jié)再灌注，可觀察到缺血區(qū)心肌慢慢變紅色，發(fā)紺區(qū)變小，心電圖ST段逐漸下降[7]。

1.4.2 平均動脈血壓和心肌收縮功能 左側(cè)股動脈插管，連接三通和U型水銀血壓計，用于記錄平均動脈血壓(MAP)，右側(cè)頸總動脈插管至左心室，連接BioLab-410型生物信號采集和處理系統(tǒng)測定心率(HR)、左室收縮末壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)和左室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)。記錄心肌缺血前、缺血后30 min和再灌注后30 min、60 min、90 min和120 min不同時相點的平均動脈血壓和心肌收縮功能變化。

1.4.3 血清中TNF-α水平測定 采集心肌缺血前、缺血后30 min和再灌注后30 min、60 min、90 min和120 min不同時相點動脈血。均經(jīng)腹主動脈快速抽取動物血3.0 mL～4.0 mL，以3 000 r/min離心15 min，分離出血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，按ELLSA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料采用配對t檢驗或單因素隨機區(qū)組方差分析。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物分析 實驗所用SD大鼠57只，造模死亡6只，主要是因為結(jié)扎時大出血死亡1只，麻醉意外死亡1只，結(jié)扎左冠狀動脈前降支后心律失常死亡2只，再灌注后心律失常死亡2只。

2.2 平均動脈血壓和心肌收縮功能變化 冠狀動脈結(jié)扎30 min后，MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低，LEVDP明顯增高，與缺血前比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與缺血前比較，再灌注后MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低，LEVDP顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；再灌注后比缺血30 min時MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯下降，LEVDP明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且再灌注后MAP、HR、LVSP、及+dp/dtmax、-dp/dtmax在30 min時最低，60 min及以后均有所上升，LEVDP在30 min時最高，60 min后有所降低，但仍維持較高水平。詳見表1。

表1 缺血前后及再灌注后各個時相點MAP和心肌收縮功能的比較(±s)

2.3 血清中TNF-α水平測定結(jié)果 冠狀動脈結(jié)扎后30 min，大鼠血清中TNF-α明顯增高，與缺血前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；再灌注后比缺血前、缺血30 min顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且可見TNF-α再灌注30 min時含量最高，達(dá)到峰值，而在再灌注60 min呈現(xiàn)輕度下降，但在90 min～120 min仍維持較高水平。詳見表2。

表2 缺血前后及再灌注后各個時相點

2.4 血清中TNF-α水平與平均動脈壓和心肌收縮功能的相關(guān)性分析 表1結(jié)果顯示，缺血前、缺血后及再灌注各個時相點平均動脈壓和心肌收縮功能的變化基本一致。對比表1和表2，可見血清中TNF-α水平與心肌收縮功能出現(xiàn)平行的同向變化趨勢，經(jīng)統(tǒng)計處理顯示兩者間存在顯著相關(guān)性。缺血30 min時，TNF-α明顯高于缺血前，心肌收縮功能較缺血前明顯降低；再灌注30 min時，TNF-α顯著高于缺血前、缺血30 min，心肌收縮功能較缺血前、缺血30 min顯著降低，并且此時TNF-α峰值最大，同時心肌收縮功能峰值最小；隨著再灌注進(jìn)行到60 min、90 min和120 min時相點，TNF-α略低于再灌注30 min，但是仍然維持在較高水平，同時在60 min、90 min和120 min時相點時，心肌收縮功能相對于再灌注30 min有所上升，但是整體水平仍然保持在較低水平。隨著TNF-α逐漸上升心肌收縮功能逐漸下降。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是臨床心絞痛、急性心肌梗死(AMI)早期再灌注、經(jīng)皮穿刺冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)及心臟移植術(shù)后等心功能不全和心律失常的主要病理基礎(chǔ)[8，9]，再灌注性心律失常是心肌缺血再灌注損傷中的一種主要表現(xiàn)形式，特別是室性心動過速及心室顫動。研究證實缺血預(yù)適應(yīng)對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可減少惡性心律失常的發(fā)生。心肌缺血再灌注損傷的臨床表現(xiàn)是心肌收縮功能下降、冠脈功能障礙、微小血管受損，并發(fā)生心肌組織水腫、黏附因子增加和白細(xì)胞浸潤，從而引起細(xì)胞凋亡與心肌梗死，最終導(dǎo)致心臟功能減弱[10]。Sihvola等[11]的實驗也顯示TNF-α參與心肌重構(gòu)的過程，是心肌凋亡的中介環(huán)節(jié)。并且TNF-α有直接的負(fù)性肌力作用，還可使細(xì)胞及生化異常，產(chǎn)生間接的負(fù)性肌力作用，抑制心肌收縮功能。TNF-α主要是有激活單核巨噬細(xì)胞分泌的一類以自分泌為主要作用方式，并且有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，產(chǎn)生于單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、某些應(yīng)激狀態(tài)下的成熟心肌細(xì)胞及體內(nèi)多種其他細(xì)胞。健康心臟中僅有極低含量表達(dá)。在缺血和應(yīng)激狀態(tài)下，TNF-α可由成熟心肌細(xì)胞合成、分泌并參與多種心臟疾病的病理過程。 本次實驗發(fā)現(xiàn)心臟冠狀動脈結(jié)扎30 min再灌注后TNF-α含量明顯增加，表明心肌組織進(jìn)行再灌注時產(chǎn)生大量的TNF-α。TNF-α通過激活肽水解酶及蛋白水解酶講解關(guān)鍵性收縮蛋白，包括肌鈣蛋白，影響心肌收縮。TNF-α水平的升高與心肌功能抑制有明顯的相關(guān)性，在心肌缺血再灌注損傷發(fā)展過程中。TNF-α可導(dǎo)致缺血后心肌功能不良，其主要機制是通過對心肌收縮力的直接影響而抑制心肌收縮功能和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

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(本文編輯 郭懷印)

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10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．006

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2015-01-23)