褪黑素對阿爾茨海默病小鼠腦內炎癥反應的影響

余彩霞 楊夢華 徐婷 譚軍 汪才俠

1.河南省商城縣人民醫院內三科，河南商城465350；2.新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科，河南新鄉453003

褪黑素對阿爾茨海默病小鼠腦內炎癥反應的影響

余彩霞1楊夢華1徐婷1譚軍2汪才俠1

1.河南省商城縣人民醫院內三科，河南商城465350；2.新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科，河南新鄉453003

目的觀察褪黑素對阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）小鼠腦內炎癥反應的影響。方法采用側腦室注射β-淀粉樣多肽（Aβ1-42）誘導AD小鼠模型，隨機分為兩組：生理鹽水對照組和褪黑素（melatonin，MT）治療組（MT處理組）。治療組予50 mg/（kg·d）褪黑素腹腔注射治療，每日1次，連續14 d；生理鹽水對照組分別予等體積的生理鹽水，每日1次，連續注射14 d。14 d后檢測各組小鼠學習記憶能力，觀察海馬組織小膠質細胞和星形膠質細胞的變化，同時進行細胞因子IL-1β和炎癥信號通路NF-κB-p65的檢測。結果褪黑素治療組與對照組比較，褪黑素組小鼠的學習記憶能力提高，小膠質細胞活化受到抑制，炎癥細胞因子IL-1β分泌減少。結論褪黑素對Aβ1-42誘導的炎癥反應表達有抑制作用，可能與其抑制NF-κB-p65有關。

阿爾茨海默病；β-淀粉樣多肽；褪黑素；炎癥反應；炎癥信號通路

阿爾茨海默病（Alzheimer’s dementia，AD）是常見的神經系統退行性疾病，臨床表現為進行性的記憶障礙，逐漸失去語言和思考能力，直至記憶能力完全喪失。病理特征表現為老年斑的沉積、神經元纖維纏結、神經元丟失和神經炎癥反應[1-4]，且日趨增多，給社會帶來越來越沉重的負擔[5]。本研究自2010年12月～2013年12月采用單側側腦室注射Aβ1-42造成AD的小鼠模型，同時予褪黑素（melatonin，MT）處理，從炎癥細胞、炎癥因子和NF-κB炎癥信號通路等方面觀察MT對AD小鼠腦內炎癥反應的影響，探討MT抗AD腦內炎癥反應的機制，為MT的臨床應用提供一定的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

β-淀粉樣多肽（beta-amyloid，Aβ）購自美國Sigma公司，將Aβ溶于無菌生理鹽水，置37℃恒溫箱內孵育7 d即為聚集態的Aβ。褪黑素（melatonin，MT）購自Sigma公司。MT注射液的配置：將MT以少量無水乙醇助溶，加生理鹽水致MT濃度為5 mg/mL，避光，4℃保存備用。

1.2 實驗動物

健康雄性SAM-P8小鼠，5月齡，體重35～40 g，均由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK（京）2002-0001。動物自由攝食飲水，環境溫度18℃～22℃，濕度40%，安靜，人工晝夜（12/12 h，從7：00～19：00給足光線）。所有實驗參照美國國家衛生研究院關于保護和使用實驗動物的指導原則以及動物保護和使用委員會的指導方針執行。

1.3 動物分組

先用側腦室注射Aβ的方法制備AD動物模型小鼠，選用造模后的AD模型小鼠48只，隨機分為兩組：生理鹽水對照組（24只）和MT處理組（24只）。造模后第1天腹腔注射給藥，MT處理組予50 mg/（kg·d）褪黑素腹腔注射治療，連續14 d；生理鹽水對照組予等體積的生理鹽水，每日1次，連續注射14 d。

1.4 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮由中國醫學科學院研制，實驗開始，由將兩組AD模型小鼠頭朝池壁放入水中，觀察并記錄動物在60 s內自入水到找到平臺所需要的時間為逃避潛伏期（escape latency），并記錄下動物在水中的游泳軌跡。若動物在60 s內沒有找到平臺，人為將動物引上平臺，潛伏期記為60 s，讓小鼠在平臺上休息10 s。空間探索實驗（spatial probe test）：定位航行實驗后，撤去平臺，助手將小鼠面向池壁從第一象限放入水中，記錄小鼠60 s內穿越平臺的次數。

1.5 觀察指標

兩組AD模型小鼠水迷宮實驗結束后，應用多聚甲醛灌注、固定、取腦，制作腦組織切片。通過免疫組化檢測測量兩組海馬組織陽性染色細胞數、小膠質細胞的面積百分比，應用ELISA法觀察兩組海馬炎性因子IL－1水平，應用Westem blot方法檢測兩組細胞核內NF－κB－p65蛋白的表達。

1.6 統計學處理

實驗數據中計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS統計學軟件進行分析，組間比較采用t檢驗。水迷宮實驗中的逃避潛伏期用重復測量的多因素方差分析；水迷宮實驗中的空間探索試驗的穿越平臺次數用完全隨機設計的方差分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素對學習記憶的影響

連續治療14 d后，行Morris水迷宮檢測，MT處理組小鼠的逃避潛伏期較對照組明顯減少，差異有統計學意義[（23．1±1．4）s vs（40．1±1．4）s，t=4．327，P＜0．01]。見圖1 A。穿越平臺次數較對照組明顯增加，差異有統計學意義[（4．1±1．1）次vs（2．1±1．2）次，t=10．216，P＜0．01]。見圖1B。

2.2 褪黑素對星形膠質細胞和小膠質細胞的影響

48只AD模型小鼠經免疫組化后，對照組海馬組織陽性染色細胞密集，胞體較大。而MT處理組陽性細胞數少，陽性細胞面積較對照組減少30．1%，差異有統計學意義[（4．5±0．1）%vs（6．3±0．1）%，t=2．705，P＜0．05]。見圖2 A、B、E。采用免疫細胞化學法觀察褪黑素對Aβ誘導小膠質細胞的影響，結果顯示，MT處理組小鼠腦內小膠質細胞的面積百分比較對照組減少23．2%，差異有統計學意義[（4．1±0．2）%vs（5．7±0．2）%， t=2．463，P＜0．05]。見圖2 C、D、F。

2.3 褪黑素對IL-1β的影響

應用ELISA法觀察褪黑素對Aβ誘導小鼠海馬炎性因子IL－1β的影響，結果表明，與對照組比較，MT處理組小鼠海馬炎癥細胞因子IL－1β水平明顯減少，差異有統計學意義[（62．2±1．2）%vs（101．1±1．3）%，t= 8．013，P＜0．01]，見圖3，說明褪黑素能夠降低Aβ誘導小鼠海馬炎性因子IL－1β的表達。

2.4 褪黑素對AD模型小鼠腦內NF-κB炎癥信號通路的影響

圖1 MT處理組與對照組小鼠Morris水迷宮學習與記憶檢測結果比較

圖2 MT處理組與對照組小鼠星形膠質細胞和小膠質細胞比較

NF－κB炎癥信號通路與炎癥細胞和炎癥因子IL－1β的分泌密切相關，應用Western blot方法檢測細胞核內NF－κB－p65的表達變化，結果顯示，MT處理組與對照組相比，細胞核內NF－κB－p65顯著減少，差異有統計學意義[（0．60±0．02）U vs（1．00±0．03）U，t=4．729，P＜0．01]。見圖4。

圖3 MT處理組與對照組IL-1β表達的比較

圖4 MT處理組與對照組NF-κB-p65表達的比較

3 討論

AD的病因及發病機制復雜，Aβ的蓄積是AD病理發生過程中一個病理特征之一。實驗證明聚集態的Aβ有神經毒性作用。動物側腦室Aβ注射是目前一種較好的誘導AD動物模型的方法。1991年Flood等[6]向小鼠腦室內注射Aβ，首次觀察到這些Aβ片段可以引起小鼠的學習記憶能力障礙。相繼有許多實驗室采用中樞注射Aβ的方法觀測到Aβ在腦內的沉積，并伴有小鼠和小鼠的空間學習記憶障礙[7]。提出Aβ腦內注射可被用于AD的動物模型，之后Aβ腦內注射建立AD動物模型的方法得到廣泛的應用。

AD是進行性的腦功能障礙，近年來，炎癥反應在AD發生中的作用受到普遍關注，AD患者的尸檢報告顯示，患者的SP及其附近發現有大量激活的小膠質細胞、星形膠質細胞及炎癥反應產物：如炎性細胞因子IL－1β等的高表達[8]。AD患者的血液和腦脊液中也發現有TNF－α和IL－1β水平升高。流行病學研究發現，在長期服用非甾體類抗炎藥（NSAIDS）的人群中，AD的發病率明顯降低[9]，以上研究均表明，炎癥反應在AD的發病過程中起著至關重要的作用。

小膠質細胞的活化狀態與AD腦內的炎癥反應關系密切。小膠質細胞與神經元共培養發現，有小膠質細胞存在時，Aβ對培養的神經元毒性作用更加明顯。抑制小膠質細胞活性則有明顯的神經保護作用。抗炎類藥物在AD治療中得到普遍關注，抗炎藥物可以延緩AD的病理進程，推遲AD的發生[10]。因此，抗炎藥物的開發和利用對AD的預防和治療非常重要。小膠質細胞膜上的受體可以與Aβ形成復合物而相互作用，其結果是引起膠質細胞活化并分泌更多的炎性因子，導致炎癥損傷。

老年斑的沉積引起小膠質細胞的活化，導致小膠質細胞內炎癥信號傳導通路的激活，引起炎性細胞因子COX－2等基因表達，其中有NF－κB炎癥信號通路參與。NF－κB是活化細胞早期轉錄因子。NF－κB主要是由P65和P50蛋白亞基組成的同源或異源二聚體組成。細胞在靜息狀態下，NF－κB與IκB結合，以非活性狀態形式存在于細胞漿中。外界致炎物質刺激小膠質細胞后，在蛋白激酶作用下，IκB與NF－κB解離，IκB磷酸化，被蛋白酶小體降解，將NF－κB釋放出來變為活化狀態，從細胞漿轉移進入細胞核，調節下游基因的表達，NF－κB炎癥信號通路在小膠質細胞的激活和分泌炎性細胞因子過程中發揮重要作用[11]。

有研究顯示，AD與海馬結構的功能退化密切相關，海馬結構是大腦邊緣系統的重要組成部分，位于側腦室下角底及內側壁，與情緒、學習、記憶、行為及免疫調節有關[12]。邊緣系統包括海馬結構、海馬旁回、齒狀回、扣帶回、乳頭體及杏仁核，這些結構通過帕帕茲環相互聯系，使中腦、間腦和新皮質結構之間發生信息交換，其中海馬結構是AD首要損傷的區域。1987年Maurizi[13]首先提出褪黑素（molatonin，MT）的缺失可能與AD發病有關。1997年Maurizi[14]又指出MT的減少可以解釋AD病理變化的區域性和神經系統特異性分布等特征。實驗和臨床研究都顯示，患者存在MT合成和分泌下降、節律紊亂等多方面的異常，AD患者缺乏MT正常的晝夜節律[15]。Liu等[16]研究發現老年人尤其是AD患者腦脊液中MT水平明顯減少。MT作為松果體分泌的一種激素，其抗炎作用是近幾年的研究熱點。本實驗免疫組化檢測示，AD模型組海馬小膠質細胞和星形膠質細胞增生，陽性細胞面積百分比增加。褪黑素治療組海馬陽性細胞面積百分比減少，結果表明側腦室注射Aβ1-42可激活腦內小膠質細胞和星形膠質細胞，引起膠質細胞增生和活化，炎癥細胞因子分泌增加。IL-1β在AD患者腦內表達增高，并與AD的主要神經病理改變的發生、發展直接相關。已有眾多研究提示抗炎藥物可延緩AD的發展和推遲AD的發生[10]。越來越多的研究表明，AD是一個慢性炎癥過程，在AD患者腦內存在嚴重的免疫和炎癥反應[17-19]，而褪黑素可以抑制炎癥細胞因子的分泌，減緩海馬結構的退變[20]，提示褪黑素有抑制AD小鼠模型腦內小膠質細胞增生和活化，從而抑制AD腦內炎癥反應。本研究還發現，褪黑素能夠降低Aβ誘導的小膠質細胞NF-κB的表達并拮抗炎癥細胞因子IL-1β的釋放，因此，推測褪黑素拮抗Aβ誘導的小膠質細胞活化和炎性細胞因子分泌增加的分子機制可能與抑制NF-κB炎癥信號通路表達有關，但是其確切的抗炎機制仍需進一步探討。

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The effect of melatonin on inflammation reaction in mice with alzheimer’s disease

YU Caixia1YANG Menghua1XU Ting1TAN Jun2WANG Caixia1
1.The Third Department of Internal Medicine,Shangcheng County People's Hospital in He'nan Province,Shangcheng 465350,China;2.Department of Neurology,the Third Hospital Affiliated Xinxiang Medical University,Xinxiang453003, China

Objectives To investigates the effect of melatonin（MT）on inflammation reaction in mice with alzheimer’s disease（AD）.Methods The mice of AD model induced by injection of beta-amyloid（Aβ1-42）were divided randomly into two groups：MT-treated group and vehicle-treated group.MT-treated group were treated with MT（50 mg/kg·day）, and vehicle-treated groupwere were treated with vehicle for 14 days.The learning and memory capacity were tested, and the changes of microglia,astrocytes,and the expression of IL-1β and NF-κB-p65 were observed in two groups. Results Compared with the control group,the learning and memory ability of melatonin treatment group mice increased, the activation of microglia was inhibited,and the secretion of inflammatory cytokines IL-1 beta decreased.Conclusion MT may inhibit Aβ-induced increase in inflammation reaction through a pathway associated with NF-κB-p65 inflammatory signaling pathway.

Alzheimer’s Disease；Beta-amyloid；Melatonin;Inflammation reaction；Inflammatory signaling pathway

R749.16

A

1673-9701（2015）27-0020-04

2015－06－23）