α—半乳糖苷酶基因工程菌細(xì)胞破碎條件的篩選

林莉萍等

摘要：研究大腸桿菌表達(dá)的水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌菌體破碎的條件。以菌液酶活性為指標(biāo)，用超聲波破碎、溶菌酶降解及菌體反復(fù)凍融3種方法破碎細(xì)胞。結(jié)果表明：超聲波功率為200 W、破碎時(shí)間為1 min時(shí)測(cè)得的菌液酶的活性最大，為7.757 7

U/mL，細(xì)胞破碎效果最好；菌體反復(fù)凍融條件下測(cè)得的菌液酶活性隨凍融次數(shù)的增加而增大，但樣品處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；菌液酶活性隨加入溶菌酶濃度增加而增加，但有處理時(shí)間長(zhǎng)、用量大、細(xì)胞破碎不完全的缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：α-半乳糖苷酶；超聲波破碎；溶菌酶；反復(fù)凍融

中圖分類號(hào)：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2014）10-0037-03

α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase， EC 3.2.1.22）屬外切糖苷酶，其專一性地催化半乳聚糖中非還原末端α-半乳糖苷鍵的水解，并能作用于含有α-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂質(zhì)，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，在食品、醫(yī)藥、飼料等諸多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。許多微生物來(lái)源的或用基因工程菌表達(dá)的α-半乳糖苷酶屬胞內(nèi)酶，需要破碎細(xì)胞壁以釋放其活性。細(xì)胞壁的破碎方法很多，已有研究者用研磨、超聲波、高壓勻漿、酸洗玻璃珠漩渦振蕩、反復(fù)凍融、酶解、煮沸等方法來(lái)破碎細(xì)胞壁提取胞內(nèi)活性物質(zhì)。

本研究以大腸桿菌表達(dá)的水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌為對(duì)象，比較采用超聲波破碎、溶菌酶降解及菌體反復(fù)凍融3種方法破碎菌體對(duì)酶活性釋放的影響，篩選最適的破碎條件，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)酶的純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌（pET32-84411/Origami），由沈陽(yáng)師范大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供；所用試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器設(shè)備

潔凈工作臺(tái)，全溫培養(yǎng)振蕩器，恒溫水浴槽，超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌體制備 將水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌按接種量5.0%接種于LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50.0 μg/mL、卡那霉素15.0 μg/mL、四環(huán)素12.5

μg/mL）中，加入0.7%的IPTG，20 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)48 h，然后在4 ℃下以5 000 r/min離心15min，獲得菌體沉淀。

1.3.2 α-半乳糖苷酶基因工程菌細(xì)胞破碎條件 按所獲得固體菌體質(zhì)量的4倍體積加入HEPES緩沖液（pH=7.0），采用以下3種方法進(jìn)行菌體破碎，然后在4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，取上清液待測(cè)。破碎方法：1） 在超聲波條件下破碎細(xì)胞。將超聲波功率分別設(shè)置為100 W，200 W，300 W，400 W，處理時(shí)間30～180 s。2） 在反復(fù)凍融條件下破碎細(xì)胞。將加有緩沖液的菌體放入-80 ℃的冰箱里快速凍結(jié)，之后置于冰浴溶解，凍融的次數(shù)分別為1次、3次、5次、7次、9次。3） 在加溶菌酶條件下破碎細(xì)胞。將溶菌酶按濃度1，2，3，4，5 mg/mL加入重懸菌液中，于室溫下處理1，2，3，4，5 h。

1.3.3 α-半乳糖苷酶活性的測(cè)定 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波對(duì)菌體細(xì)胞破碎的影響

4種超聲波功率不同時(shí)間下菌體細(xì)胞破碎結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見(jiàn)：200 W超聲波破碎處理下酶的活性最強(qiáng)；隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)菌液的酶活性增強(qiáng)，破碎時(shí)間在90 s之后酶活性的增長(zhǎng)趨于緩慢。說(shuō)明破碎功率過(guò)大或過(guò)小對(duì)α-半乳糖苷酶活性都會(huì)有負(fù)效應(yīng)。

2.2 反復(fù)凍融對(duì)菌體細(xì)胞破碎的影響

反復(fù)凍融條件下菌體細(xì)胞破碎結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見(jiàn)，隨著凍融次數(shù)的增加酶活性釋放顯著增強(qiáng)，5次以后趨于平緩。

2.3 溶菌酶對(duì)菌體細(xì)胞破碎的影響

溶菌酶對(duì)菌體細(xì)胞壁的作用如圖3和圖4所示。

由圖3和圖4可見(jiàn)：當(dāng)溶菌酶的作用時(shí)間達(dá)到3 h，濃度達(dá)到2 mg/mL之后，酶活性趨于穩(wěn)定。但總體而言，對(duì)α-半糖苷酶酶活性影響有限。

2.4 不同破碎條件對(duì)菌體細(xì)胞破碎影響的比較

就酶活性而言，圖5對(duì)比了5種不同破碎條件對(duì)α-半糖苷酶酶活性的影響。可見(jiàn)，超聲波功率為200 W時(shí)破碎1 min時(shí)獲得菌液的酶活性是最高的，而溶菌酶處理及菌體反復(fù)凍融均沒(méi)有取得理想效果。

3 結(jié)論

超聲波對(duì)大腸桿菌表達(dá)的α-半乳糖苷酶菌體細(xì)胞的破碎是最為有效的，當(dāng)破碎時(shí)間為1 min、功率為200 W時(shí)，α-半乳糖苷酶基因工程菌菌液酶活性最高達(dá)到7.757 7 U/mL，且操作簡(jiǎn)單，處理時(shí)間短。反復(fù)凍融和溶菌酶處理雖然也是破碎菌體細(xì)胞壁的有效方法，但對(duì)酶活性的負(fù)效應(yīng)較大。

參考文獻(xiàn)

[1] 李蘇紅，朱旻鵬，李拖平.重組水稻α-半乳糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2010，31（21）：304-307.

[2] BOZENA C，ANNEKATRIN D，KARIN K.Regulation of alpha-galactosidase gene expression in primary foliage leaves of barley

（Hordeum vulgare L.） during dark-induced senescence[J].Planta，2004，218（5）：886-889.

[3] CHROST B，KRUPINSKA K.Gene with homologies to known α-galactosidase are expressed during senescence of barley leaves[J].

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thermophilic fungus Themomyces lanuginosus[J].Biochem.Biophys.Acta，2000（1524）：27-37.

[6] 楊翠竹，李艷，阮南，等.酵母細(xì)胞破壁技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].食品科技，2006（7）：138-142.

[7] 李蘭，張明霞，袁金輝.不同破壁方法對(duì)細(xì)菌產(chǎn)SOD活性的影響[J].食品工業(yè)科技，2008，29（10）：108-111.

Abstract： The research studies the E.coli expressed rice. It studied cell disruption conditions of α-Galactosidase Gene Engineering. It used 3 methods for the examination： ultrasonic-break， lysozyme treatment， and thalli repeated freeze-thaw to disrupt cells， using liquid enzyme activity as indicator. The results showed that the optimal disruption is ultrasonic-breaking at power 200 W for 1 min and the α-galactosidase activity was yield at 7.757 7 U/mL； under the condition of thalli repeated freeze-thaw， the liquid enzyme activity increased with the number of freeze-thaw increasing， but the treatment time is too long； similarly， the α-galactosidase activity was enhanced by a rise of the lysozyme concentration and prolongation of treatment time， whereas， it was limited by longer treating time， higher lysozyme dosage and incomplete cell break.

Key words： α-galactosidase； ultrasonic-breaking； lysozyme； freeze-thawing

Physiol.Plant，2000（110）：111-119.

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Abstract： The research studies the E.coli expressed rice. It studied cell disruption conditions of α-Galactosidase Gene Engineering. It used 3 methods for the examination： ultrasonic-break， lysozyme treatment， and thalli repeated freeze-thaw to disrupt cells， using liquid enzyme activity as indicator. The results showed that the optimal disruption is ultrasonic-breaking at power 200 W for 1 min and the α-galactosidase activity was yield at 7.757 7 U/mL； under the condition of thalli repeated freeze-thaw， the liquid enzyme activity increased with the number of freeze-thaw increasing， but the treatment time is too long； similarly， the α-galactosidase activity was enhanced by a rise of the lysozyme concentration and prolongation of treatment time， whereas， it was limited by longer treating time， higher lysozyme dosage and incomplete cell break.

Key words： α-galactosidase； ultrasonic-breaking； lysozyme； freeze-thawing

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[7] 李蘭，張明霞，袁金輝.不同破壁方法對(duì)細(xì)菌產(chǎn)SOD活性的影響[J].食品工業(yè)科技，2008，29（10）：108-111.

Abstract： The research studies the E.coli expressed rice. It studied cell disruption conditions of α-Galactosidase Gene Engineering. It used 3 methods for the examination： ultrasonic-break， lysozyme treatment， and thalli repeated freeze-thaw to disrupt cells， using liquid enzyme activity as indicator. The results showed that the optimal disruption is ultrasonic-breaking at power 200 W for 1 min and the α-galactosidase activity was yield at 7.757 7 U/mL； under the condition of thalli repeated freeze-thaw， the liquid enzyme activity increased with the number of freeze-thaw increasing， but the treatment time is too long； similarly， the α-galactosidase activity was enhanced by a rise of the lysozyme concentration and prolongation of treatment time， whereas， it was limited by longer treating time， higher lysozyme dosage and incomplete cell break.

Key words： α-galactosidase； ultrasonic-breaking； lysozyme； freeze-thawing